Question

【題目】圖甲表示含有目的基因D的DNA片段長度（bp即堿基對）和部分堿基序列，圖乙表示一種質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)和部分堿基序列�，F(xiàn)有Msp Ⅰ、 BamH Ⅰ、Mbo Ⅰ、Sma Ⅰ4種限制性核酸內(nèi)切酶切割的堿基序列和酶切位點分別為C↓CGG、G↓GATCC、↓GATC、CCC↓GGG。請回答下列問題：

【1】用圖甲中的外源DNA（含有目的基因D）和圖乙中的質(zhì)粒構(gòu)建重組質(zhì)粒需要使用限制酶和______________________________。前者（酶）的專一性很強，其作用特點是________________________________________。

【2】應(yīng)該使用限制酶BamH Ⅰ同時處理質(zhì)粒外源DNA，而不選擇其他3種，原因在于（ ）

A.若使用Sma Ⅰ或者Msp I會破壞目的基因。

B.若使用Sma Ⅰ切割質(zhì)粒，能成功切開質(zhì)粒得到粘性末端的可能很低。

C.若使用Mbo Ⅰ切割質(zhì)粒，質(zhì)粒上會有2處被切開，會將質(zhì)粒切成兩段不利于篩選。

D.使用限制酶BamH Ⅰ能保證目的基因和質(zhì)粒獲得相同的粘性末端，以便目的基因和運載體定向連接，不至于反向連接。

E.使用BamH Ⅰ切割質(zhì)粒質(zhì)粒上會有1處被切開，破壞抗生素A抗性基因，保留抗生素B抗性基因，以便于將來篩選含目的基因的受體細胞。

F.只有使用BamH Ⅰ切割，才能保證質(zhì)粒和目的基因上產(chǎn)生相同的粘性末端。

【3】若圖甲中虛線方框內(nèi)的堿基對被T-A堿基對替換，那么基因D就突變?yōu)榛��?/span>d。從雜合子分離出圖甲及其對應(yīng)的DNA片段，用限制酶Sma Ⅰ完全切割，產(chǎn)物中共有_________種不同DNA片段。若同時用限制酶Msp Ⅰ、Mbo Ⅰ切割圖乙中的質(zhì)粒，則可得到__________個DNA片段。

【4】為了篩選出成功導(dǎo)入含目的基因D的重組質(zhì)粒的大腸桿菌，一般可進行如下步驟篩選：

第一步：將大腸桿菌在含__________的培養(yǎng)基上，得到如下左圖的菌落。

第二步：再將滅菌絨布按到培養(yǎng)基上，使絨布面沾上菌落，然后將絨布按到含__________的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，得到如下右圖的結(jié)果（空圈表示與左圖對照無菌落的位置）。

第三步：選出左圖培養(yǎng)皿中的某些菌落進行培養(yǎng)，即可得到含重組質(zhì)粒的大腸桿菌。請在下方左圖中圈出含目的基因的重組質(zhì)粒的大腸桿菌的菌落__________。

【5】以上篩選方式至少需要兩步，其實還有其他更簡單的操作方法。請閱讀下列材料，回答問題：

大腸桿菌pUC118質(zhì)粒的某限制酶唯酶切序列，位于該質(zhì)粒的lacZ基因中。lacZ基中如果沒有插入外源基因，便可表達出β一半乳糖苷酶。當(dāng)培養(yǎng)基中含有A物質(zhì)時，A物質(zhì)便會被β一半乳糖苷酶水解成藍色，大腸桿菌將形成藍色菌落；如果lacZ基因中插入了外源基因，帶有pUC118質(zhì)粒的大腸桿菌便不能表達β一半乳糖苷酶，培養(yǎng)基中的A物質(zhì)不會被水解成藍色，大腸桿菌將形成白色菌落。pUC118質(zhì)粒還攜帶了氨芐青霉素抗性基因。下圖是利用a基因篩選重組質(zhì)粒示意圖。

用下圖中的培養(yǎng)基中篩選導(dǎo)入了重組質(zhì)粒的受體大腸桿菌，制備時除含有大腸桿菌必需的葡萄糖、氮源、無機鹽、水、生長因子等營養(yǎng)物質(zhì)外還應(yīng)加入物質(zhì)應(yīng)包括（ ）

A.伊紅美藍試劑B.瓊脂C.A物質(zhì)D.氨芐青霉素

【6】將上述處理后的大腸桿菌置于圖中培養(yǎng)基上培養(yǎng)，以檢測受體大腸桿菌是否導(dǎo)入重組質(zhì)粒，結(jié)果可能出現(xiàn)藍色或者白色菌落，其中__________色大腸桿菌菌落即為含重組質(zhì)粒的目的菌。

Answer 1

【答案】

【1】 DNA連接酶 能夠識別特定的堿基序列并加以切割

【2】ACE

【3】 4 3

【4】 抗生素B 抗生素A

【5】BCD

【6】白

【解析】

基因工程中需要使用的基本工具有限制性核酸內(nèi)切酶、DNA連接酶和運載體，其中限制性核酸內(nèi)切酶的特點是能夠識別特定的堿基序列并加以切割。對目的基因和運載體進行處理時需要選擇可以產(chǎn)生相同粘性末端的限制酶，同時要保證運載體上標(biāo)記基因的完整，以便后續(xù)進行檢測。

【1】用圖甲中的外源DNA（含有目的基因D）和圖2中的質(zhì)粒構(gòu)建重組質(zhì)粒需要使用限制酶和DNA連接酶；限制酶的專一性很強，其作用特點是能夠識別特定的堿基序列并加以切割；

【2】A、若使用SmaⅠ或者MspⅠ會從目的基因的內(nèi)部切割，會破壞目的基因，A正確；

B、之所以不用SmaⅠ限制酶，原因是這種酶切割目的基因會破壞目的基因，同時利用這種酶切割質(zhì)粒，不可能得到粘性末端，B錯誤；

C、若使用MboⅠ切割質(zhì)粒，由于其識別的序列為GATC，質(zhì)粒上會有2處被切開，并且導(dǎo)致兩個抗性基因均會被破壞，這將不利于篩選，C正確；

D、使用限制酶BamHⅠ切割目的基因和質(zhì)粒，使目的基因和質(zhì)粒獲得相同的粘性末端，但這會導(dǎo)致目的基因和運載體反向連接，D錯誤；

E、使用BamHⅠ切割質(zhì)粒，觀察質(zhì)粒上的識別序列可以發(fā)現(xiàn)，質(zhì)粒上會有1處被切開，導(dǎo)致抗生素A抗性基因被破壞，保留抗生素B抗性基因，這樣便于將來篩選含目的基因的受體細胞，E正確；

F、利用BamHⅠ或MboⅠ切割，能保證質(zhì)粒和目的基因上產(chǎn)生相同的粘性末端，F錯誤；

故選ACE；

【3】雜合子的基因型為Dd，其中D基因片段有兩個SmaⅠ酶切位點，完全切割后出現(xiàn)三個片段長度分別是537bp、790bp、661bp，發(fā)生基因突變后的d基因片段只有一個SmaⅠ酶切位點，完全切割后出現(xiàn)兩個片段長度分別是1327bp、661bp，所以從雜合子中分離的DNA片段被限制酶SmaⅠ完全切割后形成會4種不同的DNA片段；限制酶MspⅠ在質(zhì)粒上存在一個酶切位點，而限制酶MboⅠ在質(zhì)粒上存在于兩個酶切位點，因此同時用限制酶MspⅠ、MboⅠ切割圖2中的質(zhì)粒，則可得到3個DNA片段；

【4】分析圖解可知，該基因工程中，最好選擇限制酶BamHⅠ切割目的基因和質(zhì)粒，但是利用該酶切割將會破壞抗生素A抗性基因，則抗生素B抗性基因為重組質(zhì)粒中的標(biāo)記基因，在篩選過程中，首先讓大腸桿菌在含抗生素B的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，得到圖3的菌落是含有目的基因及抗生素B抗性基因的菌落；再將滅菌絨布按到培養(yǎng)基上，使絨布面沾上菌落，然后將絨布按到含抗生素A的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，得到圖4的結(jié)果，則圖4中的菌落是既含抗生素B抗性基因又含有抗生素A抗性基因的菌落，所以選出圖3中有但圖4中對應(yīng)部位沒有的菌落進行培養(yǎng)，就可以得到含重組質(zhì)粒的大腸桿菌，如圖。

【5】根據(jù)題意可知，pUC118質(zhì)粒還攜帶了氨芐青霉素抗性基因，因此制備培養(yǎng)基時需要加入氨芐青霉素進行篩選，同時還需要加入瓊脂作為培養(yǎng)基的凝固劑，A物質(zhì)用于鑒定lacZ基因是否被破壞；

故選BCD。

【6】如果lacZ基因中插入了外源基因，帶有pUC118質(zhì)粒的大腸桿菌便不能表達β-半乳糖苷酶，培養(yǎng)基中的A物質(zhì)不會被水解成藍色，大腸桿菌將形成白色菌落，因此其中白色大腸桿菌菌落即為含重組質(zhì)粒的目的菌。

該題的難點為確定限制酶的識別序列從而合理的對目的基因和運載體進行切割和重組操作，該過程需要學(xué)生認(rèn)知要保證目的基因的完整性，保證質(zhì)粒上至少一個標(biāo)記基因的完整性和目的基因與運載體的合理連接，考察學(xué)生對基因工程的綜合掌握情況。