Question

【題目】基因工程中，GUS基因編碼的酶可將無色底物生成藍(lán)色產(chǎn)物，GFP基因會(huì)產(chǎn)生綠色熒光蛋白，這兩種基因都可作為標(biāo)記基因來研究發(fā)育生物學(xué)的問題。利用雙CRISPR/Cas9系統(tǒng)和Cre/loxP重組酶系統(tǒng)技術(shù)可更好地實(shí)現(xiàn)該研究。請(qǐng)據(jù)圖作答：

（1）圖1為雙CRISPR/Cas9系統(tǒng)作用示意圖。該系統(tǒng)能夠特異性識(shí)別DNA序列并切割特定位點(diǎn)，圖中行使這些功能的分子結(jié)構(gòu)分別是____________、______________。圖中向?qū)�RNA與DNA結(jié)合的原理是______________。將刪除區(qū)切割后，轉(zhuǎn)入基因與原DNA片段可通過形成_______________拼接起來，形成新的DNA序列。

（2）雙CRISPR/Cas9系統(tǒng)可直接在靶細(xì)胞內(nèi)起作用，與傳統(tǒng)的基因工程相比，該操作無需_______________（填寫工具）。與質(zhì)粒載體導(dǎo)入外源基因比，雙CRISPR/Cas9系統(tǒng)編輯的基因可以不含________________.

（3）圖2為Cre/loxP重組酶系統(tǒng)作用示意圖。利用雙CRISPR/Cas9系統(tǒng)可精準(zhǔn)地將loxP序列、GUS基因及GFP基因連接，接上35s啟動(dòng)子之后可在組織中檢測(cè)出藍(lán)色區(qū)而無綠色熒光區(qū)，這是由于____________基因自身無啟動(dòng)子而無法表達(dá)。Cre基因是重組酶基因，經(jīng)38℃熱處理后可被激活表達(dá)，在此前提下組織中可檢測(cè)出綠色熒光區(qū)，據(jù)此分析綠色熒光區(qū)形成的原因是___________________________________________________________________________采用_________________________等手段可以擴(kuò)大組織中綠色熒光區(qū)的面積。

Answer 1

【答案】向?qū)�RNA Cas9蛋白 堿基互補(bǔ)配對(duì) 磷酸二酯鍵 載體（運(yùn)載體、質(zhì)粒） 啟動(dòng)子、終止子和標(biāo)記基因 GFP 重組酶能（特異性識(shí)別并）切割loxP序列，使GFP基因得以表達(dá) 延長(zhǎng)熱處理時(shí)間

【解析】

生物的性狀受基因控制，生物能發(fā)出綠色熒光是由于生物的DNA分子上含有綠色熒光蛋白基因，基因能通過控制蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)直接控制生物性狀；圖1為雙CRISPR/Cas9系統(tǒng)作用示意圖，由圖可知，向?qū)�RNA中有一段識(shí)別序列，具有識(shí)別功能，可以與特定的DNA序列發(fā)生堿基互補(bǔ)配對(duì)，Cas9蛋白則可切割所識(shí)別的特定DNA序列；導(dǎo)入的基因和原DNA片段之間需要重新形成磷酸二酯鍵才能連接在一起，形成新的DNA分子，該過程類似于基因工程操作中的構(gòu)建基因表達(dá)載體步驟，據(jù)此作答。

（1）圖1為雙CRISPR/Cas9系統(tǒng)作用示意圖。該系統(tǒng)能夠特異性識(shí)別DNA序列并切割特定位點(diǎn)的原因分別是向?qū)�RNA能識(shí)別特定序列、Cas9蛋白能定點(diǎn)切割DNA序列。圖中向?qū)�RNA與DNA結(jié)合的原理是堿基互補(bǔ)配對(duì)。將刪除區(qū)切割后，轉(zhuǎn)入基因與原DNA片段可通過形成磷酸二酯鍵拼接起來，形成新的DNA序列。
（2）雙CRISPR/Cas9系統(tǒng)可直接在靶細(xì)胞內(nèi)起作用，與傳統(tǒng)的基因工程相比，該操作無需載體（運(yùn)載體）。與質(zhì)粒載體導(dǎo)入外源基因比，雙CRISPR/Cas9系統(tǒng)編輯的基因可以不含啟動(dòng)子、終止子和標(biāo)記基因。
（3）GUS基因編碼的酶可將無色底物生成藍(lán)色產(chǎn)物，GFP基因會(huì)產(chǎn)生綠色熒光蛋白，在組織中檢測(cè)出藍(lán)色區(qū)而無綠色熒光區(qū)，說明GUS基因正常表達(dá)而GFP基因不能正常表達(dá)，根據(jù)“Cre基因是重組酶基因，經(jīng)38℃熱處理后可被激活表達(dá)，在此前提下組織中可檢測(cè)出綠色熒光區(qū)”提示，可見GFP基因的正常表達(dá)需以Cre基因被激活表達(dá)為前提，即GFP基因自身無啟動(dòng)子，無法啟動(dòng)自身的表達(dá)。通過用Cre重組酶處理后，切割loxP序列，產(chǎn)生GFP基因的啟動(dòng)子，使GFP基因得以表達(dá)。由于Cre基因是重組酶基因，經(jīng)38℃熱處理后可被激活表達(dá)，因此熱處理時(shí)間越長(zhǎng)，越有利于基因的表達(dá)，綠色熒光區(qū)的面積就越大。