Question

【題目】某種熒光蛋白(GFP)在紫外光或藍光激發(fā)下會發(fā)出綠色熒光，這一特性可用于檢測細胞中目的基因的表達。某科研團隊將某種病毒的外殼蛋白(L1)基因連接在GFP基因的5’末端，獲得了Ll-GFP融合基因，并將其插入質粒P0，構建了真核表達載體Pl，其部分結構和酶切位點如下圖所示，圖中El～E4四種限制酶產(chǎn)生的黏性末端各不相同�；卮鹣铝袉栴}：

(l)該團隊在將Ll-GFP融合基因插入質粒P0時，使用了兩種限制酶，據(jù)圖推斷它們是____。使用這兩種酶進行酶切是為了保證____，也是為了保證____的正確連接。

(2)為獲得含有LI-GFP融合基因的牛，可將能夠產(chǎn)生綠色熒光細胞的細胞核植入牛的____中，再進行體外培養(yǎng)、胚胎移植等相關操作。若采用胚胎分割移植技術一次獲得多頭表型相同的轉基因牛，在對處于囊胚階段的胚胎進行分割時，應注意____。

(3)為檢測Ll-GFP融合基因是否存在于克隆牛的不同組織細胞中，某同學用PCR方法進行鑒定。在鑒定時應分別以該牛不同組織細胞中的 ___作為PCR模板。利用PCR技術進行DNA擴增時，除模板外，還必須提供的物質是 __。

Answer 1

【答案】E1和E4 Ll-GFP融合基因的完整 Ll- GFP融合基因與載體 去核卵母細胞 內細胞團均等分割 核DNA 與模板鏈結合的兩種引物、四種脫氧核苷酸、耐熱的DNA聚合酶

【解析】

基因工程技術的基本步驟：

（1）目的基因的獲�。悍椒ㄓ袕幕�因文庫中獲取、利用PCR技術擴增和人工合成。

（2）基因表達載體的構建：是基因工程的核心步驟，基因表達載體包括目的基因、啟動子、終止子和標記基因等。

（3）將目的基因導入受體細胞：根據(jù)受體細胞不同，導入的方法也不一樣。將目的基因導入植物細胞的方法有農(nóng)桿菌轉化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因導入動物細胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因導入微生物細胞的方法是感受態(tài)細胞法。

（4）目的基因的檢測與鑒定：分子水平上的檢測：①檢測轉基因生物染色體的DNA是否插入目的基因--DNA分子雜交技術；②檢測目的基因是否轉錄出了mRNA--分子雜交技術；③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質--抗原-抗體雜交技術。個體水平上的鑒定：抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等。

（1）要保證目的基因在受體細胞中能夠正確表達，目的基因的首端應有啟動子，尾端應有終止子。甲是將某種病毒的外殼蛋白（L1）基因連接在GFP基因的5ˊ末端而獲得的L1-GFP融合基因，據(jù)此結合題意并分析圖示可知：該團隊在將甲插入質粒P0時，如果用E2或E3，則目的基因不完整，而使用E1和E4這兩種限制酶進行酶切保證了甲的完整，而且也保證了甲與載體正確連接，因此，使用的兩種限制酶，是E1和E4。

（2）若要獲得含有甲的牛，可采用核移植技術，即將能夠產(chǎn)生綠色熒光細胞的細胞核移入牛的去核卵母細胞中獲得重組細胞，并將該重組細胞在體外培養(yǎng)成重組胚胎，再經(jīng)過胚胎移植等獲得含有甲的牛，若采用胚胎分割移植技術一次獲得多頭表型相同的轉基因牛，在對處于囊胚階段的胚胎進行分割時，應注意內細胞團均等分割。

（3）PCR是多聚酶鏈式反應的縮寫，是一種在生物體外復制特定DNA片斷的核酸合成技術。若利用PCR方法檢測甲是否存在于克隆牛的不同組織細胞中，則應分別以該牛不同組織細胞中的核DNA作為PCR模板，用PCR技術進行DNA擴增時，除模板外，還必須提供的物質是與模板鏈結合的兩種引物、四種脫氧核苷酸、耐熱的DNA聚合酶。