Question

【題目】（一）圖（a）中的三個(gè) DNA 片段上依次表示出了 EcoRI、BamHI 和 Sau3AI 三種限制性內(nèi)切酶的識(shí)別序列與切割位點(diǎn)，圖（b）為某種表達(dá)載體的示意圖（載體上的 EcoRI、Sau3AI 的切點(diǎn)是唯一的）

根據(jù)基因工程的有關(guān)知識(shí)，回答下列問(wèn)題：

（1）經(jīng) BamHI 酶切后得到的目的基因可以與上述表達(dá)載體被 _______________酶切后的產(chǎn)物連接。

（2）若某人利用圖（b）所示的表達(dá)載體獲得了甲、乙、丙三種含有目的基因的重組質(zhì)粒，如圖（c）所示。這三種重組質(zhì)粒中，不能在宿主細(xì)胞中表達(dá)目的基因產(chǎn)物的有_______________。不能表達(dá)的原因是___________。

（3） DNA 連接酶是將兩個(gè) DNA 片段連接起來(lái)的酶，它作用對(duì)象是 ________鍵。

（二）絲素蛋白是家蠶的一種分泌性復(fù)合蛋白，由絲素蛋白重鏈（FibH）、絲素蛋白輕鏈（Fibl）和 P25 糖蛋白組成。將 Fibl 基因?qū)�入大腸桿菌（不含質(zhì)粒 A）并實(shí)現(xiàn)表達(dá)的過(guò)程如圖所示。

①構(gòu)建重組質(zhì)粒時(shí)要用到的工具酶是________________。

②接種在含氨芐青霉素培養(yǎng)基上的大腸桿菌，有的不能形成菌落，原因是____________。

③影印接種就是用絲絨做成與平板大小相近的印章，然后把長(zhǎng)有菌落的母平板倒置在絲絨印章上，輕 輕印一下，再把此印章在新的培養(yǎng)基平板上輕輕印一下。經(jīng)培養(yǎng)后，比較新平板上長(zhǎng)出的菌落與母平板上的菌落位置，推測(cè)可能導(dǎo)入了重組質(zhì)粒的菌落是 ____________（用字母表示）。

④目的基因成功表達(dá)的標(biāo)志是_______________。

Answer 1

【答案】Sau3A I 甲、丙 甲中目的基因插入在啟動(dòng)子的上游，丙中目的基因插入在終止子的下游，兩者目的基因均不能轉(zhuǎn)錄，所以都不能表達(dá)目的基因的產(chǎn)物。 磷酸二酯鍵 限制酶和DNA連接酶 沒(méi)有導(dǎo)入質(zhì)粒 b、c 大腸桿菌合成絲素蛋白輕鏈

【解析】

1．基因工程技術(shù)的基本步驟：

（1）目的基因的獲�。悍椒ㄓ袕幕�因文庫(kù)中獲取、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增和人工合成．

（2）基因表達(dá)載體的構(gòu)建：是基因工程的核心步驟，基因表達(dá)載體包括目的基因、啟動(dòng)子、終止子和標(biāo)記基因等．

（3）將目的基因?qū)�入受體細(xì)胞：根據(jù)受體細(xì)胞不同，導(dǎo)入的方法也不一樣．將目的基因?qū)�入植物�?xì)胞的方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因?qū)�入�?dòng)物細(xì)胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因?qū)�入微生物�?xì)胞的方法是感受態(tài)細(xì)胞法．

（4）目的基因的檢測(cè)與鑒定：分子水平上的檢測(cè)：①檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA是否插入目的基因--DNA分子雜交技術(shù)；②檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA--分子雜交技術(shù)；③檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)--抗原-抗體雜交技術(shù)．個(gè)體水平上的鑒定：抗蟲(chóng)鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等．

2．基因工程的工具：

（1）限制酶：能夠識(shí)別雙鏈DNA分子的某種特定核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷裂。

（2）DNA連接酶：連接的是兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵。

（3）運(yùn)載體：常用的運(yùn)載體：質(zhì)粒、噬菌體的衍生物、動(dòng)植物病毒。

3.DNA聚合酶只能將單個(gè)核苷酸加到已有的核酸片段的3′末端的羥基上，形成磷酸二酯鍵；而DNA連接酶是在兩個(gè)DNA片段之間形成磷酸二酯鍵，不是在單個(gè)核苷酸與DNA片段之間形成磷酸二酯鍵。DNA聚合酶是以一條DNA鏈為模板，將單個(gè)核苷酸通過(guò)磷酸二酯鍵形成一條與模板鏈互補(bǔ)的DNA鏈。

（一）（1） 由于限制酶Sau3A I與BamHI切割后產(chǎn)生的片段具有相同的黏性末端，所以經(jīng)BamHI酶切割得到的目的基因可以與上述表達(dá)載體被Sau3A I酶切后的產(chǎn)物連接。

（2）啟動(dòng)子是一段有特殊序列的DNA片段，它是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，最終獲得所需要的蛋白質(zhì)。終止子也是一段有特殊結(jié)構(gòu)的DNA短片段，相當(dāng)于一盞紅色信號(hào)燈， 使轉(zhuǎn)錄在所需要的地方停止下來(lái)。在基因表達(dá)載體中，啟動(dòng)子應(yīng)位于目的基因的首端，終止子應(yīng)位于目的基因的尾端，這樣目的基因才能表達(dá)。而甲中目的基因插入在啟動(dòng)子的上游，丙中目的基因插入在終止子的下游，兩者目的基因均不能轉(zhuǎn)錄，所以都不能表達(dá)目的基因的產(chǎn)物。

（3）DNA 連接酶能催化兩個(gè) DNA 片段之間的磷酸二酯鍵形成。

（二）①構(gòu)建重組質(zhì)粒需要限制酶和DNA連接酶。

②接種在含氨芐青霉素培養(yǎng)基上的大腸桿菌，有的不能形成菌落，說(shuō)明對(duì)氨芐青霉素不具有抗性，而導(dǎo)入成功的大腸桿菌都表現(xiàn)出對(duì)氨芐青霉素的抗性，故大腸桿菌不能長(zhǎng)出菌落的原因是因?yàn)闆](méi)有導(dǎo)入質(zhì)粒。

③由圖可知，a、b、c、d都是對(duì)氨芐青霉素有抗性的大腸桿菌，說(shuō)明都是成功導(dǎo)入質(zhì)粒的大腸桿菌，圖中顯示重組質(zhì)粒中的四環(huán)素抗性基因被破壞，故導(dǎo)入重組質(zhì)粒的大腸桿菌不具有對(duì)四環(huán)素的抗性，故在含有四環(huán)素培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落是導(dǎo)入質(zhì)粒A的大腸桿菌，即圖中的a、d，b、c菌落沒(méi)有長(zhǎng)出，說(shuō)明這兩個(gè)菌落不具有對(duì)四環(huán)素的抗性，故b、c可能是導(dǎo)入重組質(zhì)粒的大腸桿菌。

④題中的目的基因是Fibl 基因，而目的基因表達(dá)成功的含義是控制形成了相應(yīng)的蛋白質(zhì)，故本題中目的基因成功表達(dá)的標(biāo)志是大腸桿菌合成絲素蛋白輕鏈。