Question

【題目】圖甲為構(gòu)建重組質(zhì)粒過程中的三種備選質(zhì)粒，其中Ap為氨芐青霉素抗性基因，Tc為四環(huán)素抗性基因。圖乙為培育轉(zhuǎn)AFPs基因（抗凍基因）番茄的示意圖，外源DNA和質(zhì)粒上均標出了酶切位點及相關(guān)抗性基因，請回答下列問題。

（1）圖甲中通常選用質(zhì)粒C構(gòu)建重組質(zhì)粒，而不選用質(zhì)粒A或質(zhì)粒B,其中不用質(zhì)粒A原因是____________________________________。

（2）據(jù)圖乙分析，若需使用插入滅活法篩選并鑒定重組質(zhì)粒，應(yīng)優(yōu)先選用限制酶_____切割目的基因和質(zhì)粒。

（3）從cDNA文庫中獲得的目的基因______（填“含有”或“不含有”）啟動子和終止子。

（4）在構(gòu)建基因表達載體過程中常把兩個啟動子串聯(lián)在一起形成雙啟動子，加在目的基因上游。雙啟動子作用是________________________。

（5）圖乙農(nóng)桿菌中的質(zhì)粒應(yīng)含有______，其作用是攜帶目的基因進入番茄細胞并整合到番茄細胞的染色體DNA。從分子水平檢測AFPs基因是否成功表達的方法是_____________。若要獲得抗凍能力更強的抗凍番茄，可以對AFPs基因進行改造，最終得到相應(yīng)的蛋白質(zhì)，該過程需用到______工程。

（6）為使改造后的AFPs基因能夠表達，人工設(shè)計質(zhì)粒D并對它的多個酶切位點進行研究。若用HindⅢ酶或KpnⅠ酶單獨切割質(zhì)粒D，均獲得一條長鏈，若用HindⅢ酶和EcoRⅠ酶同時切割，則獲得2個500bp和1個2666bp片段，若用KpnⅠ酶和EcoRⅠ酶同時切割，則獲得2個250bp和1個3166bp片段。若以HindⅢ酶切割位點為計算起點，則KpnⅠ酶切割位點與HindⅢ酶切割位點最短長度為_______，EcoRⅠ酶的兩個切割位點與HindⅢ切割位點的最短距離為_________。

Answer 1

【答案】質(zhì)粒A中沒有標記基因，質(zhì)粒B的復制原點中含有HindⅢ酶切位點 BamHⅠ和HindⅢ 不含有 保證目的基因的高效轉(zhuǎn)錄（高效表達） T-DNA 抗原-抗體雜交法 蛋白質(zhì) 750bp 500bp

【解析】

基因工程技術(shù)的基本步驟：

（1）目的基因的獲取：方法有從基因文庫中獲取、利用PCR技術(shù)擴增和人工合成。

（2）基因表達載體的構(gòu)建：是基因工程的核心步驟，基因表達載體包括目的基因、啟動子、終止子和標記基因等。

（3）將目的基因?qū)�入受體細胞：根據(jù)受體細胞不同，導入的方法也不一樣。將目的基因?qū)�入植物細胞的方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因?qū)�入動物細胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因?qū)�入微生物細胞的方法是感受態(tài)細胞法。

（4）目的基因的檢測與鑒定：分子水平上的檢測：①檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA是否插入目的基因--DNA分子雜交技術(shù)；②檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA--分子雜交技術(shù)；③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)--抗原-抗體雜交技術(shù)。個體水平上的鑒定：抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等。

（1）根據(jù)甲圖分析，質(zhì)粒A沒有標記基因，質(zhì)粒B的復制原點中含有限制酶HindⅢ切割位點，可能會破壞復制原點，而質(zhì)粒C含有多個標記基因和酶切位點，適宜作為基因工程的載體。

（2）圖乙中，選用的是質(zhì)粒C作為基因工程的載體，結(jié)合目的基因兩端的酶切位點，目的基因和載體可以選擇BamHⅠ和HindⅢ同時切割，或者選擇EcoRⅠ和HindⅢ同時切割，若需使用插入滅活法篩選并鑒定重組質(zhì)粒，應(yīng)優(yōu)先選用限制酶BamHⅠ ( 會破壞Tc為四環(huán)素抗性基因)和HindⅢ切割，可以根據(jù)是否對四環(huán)素有抗性來篩選。

（3）從cDNA文庫中獲取的目的基因不含有啟動子、終止子、內(nèi)含子等。

（4）雙啟動子作用是保證目的基因的高效表達。

（5）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法中的Ti質(zhì)粒含有的T-DNA可以攜帶目的基因進入番茄細胞并整臺到番茄細胞的染色體DNA上；從分子水平檢測AFPs基因是否成功表達的方法是抗原-抗體雜交法；對AFPs基因進行改造，進而達到改造獲得抗凍能力更強的抗凍番茄，需要通過蛋白質(zhì)工程實現(xiàn)。

（6）根據(jù)題意分析，若用HindⅢ酶或KpnⅠ酶單獨切割質(zhì)粒D，均獲得一條長鏈，說明該質(zhì)粒上只含有HindⅢ酶的一個酶切位點和KpnⅠ酶的一個酶切位點；若用HindⅢ酶和EcoRⅠ酶同時切割，則獲得2個500b和1個2666bp片段，若用KpnⅠ酶和EcoRⅠ酶同時切割，則獲得2個250bp和1個3166bp片段，說明EcoRⅠ酶有2個酶切位點，且兩個位點之間的最短距離是500bp ，而KpnⅠ酶的切點在2個EcoRⅠ酶切點之間，距離每個EcoRⅠ酶切點250bp，HindⅢ酶切點距離最近的EcoRⅠ酶切點的最短距離是500bp，距離另一個EcoRⅠ酶切點的距離是500+ 500= 1000bp， 故KpnⅠ酶切割位點與HindⅢ酶切割位點最短長度為250+500= 750bp，EcoRⅠ酶的兩個切割位點與HindⅢ切割位點的最短距離為500bp。