Question

【題目】Sanger法DNA測序的核心原理：由于雙脫氧核苷酸（ddNTP）五碳糖的2'和3'碳原子都不含羥基，在DNA合成過程中不能形成“相應化學鍵”，因此可中斷DNA分子合成反應。在四個含有4種脫氧核苷酸（dNTP）的PCR反應體系中分別加入一定比例帶有放射性同位素標記的 ddNTP（分別為ddATP、ddCTP、ddGTP和ddTTP），在PCR過程中復制隨機終止，產(chǎn)生四組不同長度的一系列終止處帶有標記的DNA片段，如圖1。然后在變性凝膠上進行電泳和放射自顯影后，可以根據(jù)電泳帶的位置確定待測分子的DNA序列，具體過程見下圖2。（注：ddA是ddATP的縮寫形式）

（1）題干中“相應化學鍵”是_____，圖1過程Ⅰ橫線①處加入的物質(zhì)的特點是________，該過程需要添加引物的原因是______________________。

（2）題干中“在變性凝膠上進行電泳……”中“變性”是指__________，其目的是_________________。

（3）某同學要通過PCR技術獲得被32P標記且以堿基“C”為末端、不同長度的子鏈DNA片段，在反應管中已有模板、引物、酶和相應緩沖液等，還需加入的原料有__________________。

（4）若模板鏈是“ 3' …TCAGCTCGAATC…5' ”，變性后電泳結(jié)果如圖2所示，則模板DNA電泳后所處的位置最可能為____（選填“a處”或“b處”），原因是__________。

Answer 1

【答案】磷酸二酯鍵 耐高溫 DNA聚合酶只能將游離的脫氧核苷酸添加到已有核酸片段上 破壞DNA分子中氫鍵，獲得單鏈 避免模板鏈對結(jié)果的影響（或使模板鏈與子鏈分離，使電泳結(jié)果直接反映子鏈的長度，便于讀序） dATP、dGTP、dTTP、dCTP 、ddCTP b處 模板DNA長度最長（分子量最大）

【解析】

聚合酶鏈式反應（PCR）是一種用于放大擴增特定的DNA片段的分子生物學技術，它可看作是生物體外的特殊DNA復制，是一項在生物體外復制特定DNA的核酸合成技術，PCR的最大特點是能將微量的DNA大幅增加。PCR的條件：模板DNA、四種脫氧核苷酸、一對引物、熱穩(wěn)定DNA聚合酶（Taq酶）。PCR的過程：①高溫變性：DNA解旋過程；②低溫復性：引物結(jié)合到互補鏈DNA上；③中溫延伸：合成子鏈。PCR擴增中雙鏈DNA解開不需要解旋酶，高溫條件下氫鍵可自動解開。

（1）DNA分子合成是以DNA的兩條鏈為模板，以游離的脫氧核苷酸為原料，合成子鏈，題干中“相應化學鍵”是磷酸二酯鍵，連接脫氧核苷酸成子鏈。圖1過程Ⅰ橫線①處加入的物質(zhì)為TaqDNA聚合酶，特點是耐高溫。該過程需要添加引物的原因是DNA聚合酶只能將游離的脫氧核苷酸添加到已有核酸片段上，需由引物先跟模板結(jié)合。

（2）PCR是體外合成DNA的方式，“變性”是指破壞DNA分子中氫鍵，獲得單鏈。其目的是避免模板鏈對結(jié)果的影響（或使模板鏈與子鏈分離，使電泳結(jié)果直接反映子鏈的長度，便于讀序）。

（3）在反應管中已有模板、引物、酶和相應緩沖液等，還需加入的原料有dATP、dGTP、dTTP、dCTP 、ddCTP，那么子鏈會在堿基“C”的地方停止合成。

（4）若模板鏈是“ 3' …TCAGCTCGAATC…5' ”，變性后電泳結(jié)果如圖2所示，則模板DNA電泳后所處的位置最可能為b處，原因是模板DNA長度最長（分子量最大）。