Question

【題目】玉米是我國(guó)重要的糧食作物和飼料來(lái)源，低溫會(huì)影響玉米的產(chǎn)量和品質(zhì)。研究者將從微生物中獲得的CSP（冷激蛋白）基因與玉米基因的ubi啟動(dòng)子相連后構(gòu)建基因表達(dá)載體，并將其導(dǎo)入玉米細(xì)胞中，獲得了具有低溫耐受性的玉米植株，過(guò)程如圖1所示。

（1）研究者提取玉米的DNA，利用PCR技術(shù)將ubi啟動(dòng)子擴(kuò)增出來(lái)。該過(guò)程需設(shè)計(jì)合適的引物，引物設(shè)計(jì)時(shí)需已知___________，為便于進(jìn)行后續(xù)操作還在引物中添加了限制酶的識(shí)別序列。在反應(yīng)體系內(nèi)，至少需___________次擴(kuò)增才能獲得所需的ubi啟動(dòng)子。

（2）圖1所示的流程圖中，過(guò)程①需___________的催化，獲得的ubi-CSP基因在構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)，在Ti質(zhì)粒上的插部位為___________。過(guò)程②需要用CaCl2溶液處理農(nóng)桿菌，其目的是___________。過(guò)程③完成后，將玉米愈傷組織轉(zhuǎn)入含___________的培養(yǎng)基中進(jìn)行篩選，篩選后的愈傷組織再經(jīng)培育獲得轉(zhuǎn)基因玉米。

（3）研究者分別提取了野生型玉米及5株轉(zhuǎn)基因玉米的染色體DNA，用限制酶處理后進(jìn)行電泳。電泳后的DNA與基因探針進(jìn)行雜交，得到圖2所示放射性檢測(cè)結(jié)果，該基因探針應(yīng)為___________片段，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明___________。

（4）在個(gè)體水平上對(duì)轉(zhuǎn)玉米植株進(jìn)行___________實(shí)驗(yàn)，可檢測(cè)CSP基因是否已在玉米中表達(dá)。

Answer 1

【答案】ubi兩端的一段序列 3 限制酶和DNA連接酶 T-DNA內(nèi)部（且不破壞hpt） 獲得感受態(tài)細(xì)胞（或:使農(nóng)桿菌處于易于吸收外源DNA的狀態(tài)） 潮霉素 含放射性同位素標(biāo)記的CSP基因 除植株3外，其他4株轉(zhuǎn)基因玉米中CSP基因均已整合到玉米染色體基因組中 低溫耐受性

【解析】

基因工程技術(shù)的基本步驟：

（1）目的基因的獲�。悍椒ㄓ袕幕�因文庫(kù)中獲取、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增和人工合成；

（2）基因表達(dá)載體的構(gòu)建：是基因工程的核心步驟，基因表達(dá)載體包括目的基因、啟動(dòng)子、終止子和標(biāo)記基因等；

（3）將目的基因?qū)�入受體細(xì)胞：根據(jù)受體細(xì)胞不同，導(dǎo)入的方法也不一樣．將目的基因?qū)�入植物�?xì)胞的方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因?qū)�入�?dòng)物細(xì)胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因?qū)�入微生物�?xì)胞的方法是感受態(tài)細(xì)胞法；

（4）目的基因的檢測(cè)與鑒定：分子水平上的檢測(cè)：①檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA是否插入目的基因--DNA分子雜交技術(shù)；②檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA--分子雜交技術(shù)；③檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)--抗原-抗體雜交技術(shù)。個(gè)體水平上的鑒定：抗蟲(chóng)鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等。

（1）在利用PCR技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，需要事先設(shè)計(jì)引物，這里需要根據(jù)ubi啟動(dòng)子設(shè)計(jì)合適的引物，因此需已知ubi兩端的一段序列，為便于進(jìn)行后續(xù)操作還在引物中添加了限制酶的識(shí)別序列。在反應(yīng)體系內(nèi)，至少需3次才能獲得引物之間的核苷酸序列，即至少需3次擴(kuò)增才能獲得所需的ubi啟動(dòng)子。

（2）圖1中，過(guò)程①為載體和目的基因相連的過(guò)程，因此需限制酶和DNA連接酶的催化從而實(shí)現(xiàn)連接，在獲得ubi-CSP基因構(gòu)表達(dá)載體時(shí)，需要將ubi-CSP基因插入T-DNA內(nèi)部（且不破壞hpt），這樣能保證T-DNA轉(zhuǎn)移時(shí)攜帶目的基因與玉米的染色體DNA連接。過(guò)程②為導(dǎo)入受體細(xì)胞的過(guò)程，為了提高導(dǎo)入的成功率，通常用CaCl2溶液處理農(nóng)桿菌，使其成為感受態(tài)細(xì)胞，因?yàn)樘幱诟惺軕B(tài)的農(nóng)桿菌易于吸收外源DNA，過(guò)程③完成后，將玉米愈傷組織轉(zhuǎn)入含潮霉素的培養(yǎng)基中進(jìn)行篩選，篩選后的愈傷組織再經(jīng)脫分化過(guò)程長(zhǎng)成幼苗，從而獲得了轉(zhuǎn)基因玉米植株

（3）圖2所示放射性檢測(cè)結(jié)果，因此這里的基因探針為含放射性同位素標(biāo)記的CSP基因片段，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在第1、2、4、5株玉米中檢測(cè)出目的基因的放射性，據(jù)此可知除植株3外，其他4株轉(zhuǎn)基因玉米中CSP基因均已整合到玉米染色體基因組中。

（4）在個(gè)體水平上，可以通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)玉米植株進(jìn)行低溫耐受性實(shí)驗(yàn)，進(jìn)而檢測(cè)CSP基因是否在玉米中成功表達(dá)。