Question

【題目】水稻是世界上最重要的糧食作物之一，是全球約半數(shù)人口的主糧。然而水稻只有在磷營養(yǎng)充足的條件下才能保證高產(chǎn)。S基因是番茄線粒體中的磷轉(zhuǎn)運蛋白基因，科研人員將S基因轉(zhuǎn)入水稻體內(nèi)，以期望獲得低磷條件下的高產(chǎn)水稻。操作流程如下：

（1）磷是構(gòu)成____等物質(zhì)的重要組成元素。土壤溶液中的磷濃度一般不超過2×10-12 mol/L，而植物細(xì)胞內(nèi)的磷濃度卻大于10×10-4 mol/L，因此植物從土壤中吸收磷的方式是____。

（2）提取番茄細(xì)胞的總RNA經(jīng)過____得到的cDNA，用限制酶處理后與載體結(jié)合并轉(zhuǎn)入受體菌體內(nèi)，建立番茄的_____，從中獲取S基因。但此途徑得到的S基因兩端沒有限制酶識別序列，利用____技術(shù)添加相應(yīng)序列并擴增。已知Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)錄方向為順時針，相關(guān)酶切位點如下表。

通過測序已知S基因部分序列如下：

請補充擴增結(jié)束后，大多數(shù)DNA片段的堿基對序列____________ 。

（3）構(gòu)建含S基因的表達(dá)載體時，通常用兩種限制酶切割含S基因的DNA片段和Ti質(zhì)粒，限制酶作用部位為____（填化學(xué)鍵名稱）。將重組Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌時，可以用____處理農(nóng)桿菌，使得表達(dá)載體易于導(dǎo)入。為了使S基因能夠正確表達(dá)，還應(yīng)插入的元件是什么_________（請在下圖中畫出并標(biāo)注元件名稱）。

（4）將表達(dá)載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌以及農(nóng)桿菌與水稻愈傷組織共培養(yǎng)時需要進(jìn)行篩選，這兩步驟的培養(yǎng)基中都需要加入____，以篩選出成功導(dǎo)入表達(dá)載體的農(nóng)桿菌和水稻愈傷組織。

（5）GUS基因的產(chǎn)物能催化無色物質(zhì)K呈現(xiàn)藍(lán)色。經(jīng)無色物質(zhì)K處理愈傷組織并篩選出了呈現(xiàn)藍(lán)色的組織，說明____。

（6）農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒上的____序列，可以從農(nóng)桿菌中轉(zhuǎn)移并隨機插入到被侵染植物細(xì)胞的____中。隨機挑選三個轉(zhuǎn)基因株系甲、乙、丙進(jìn)行陽性檢測試驗。分別提取每個樣品的基因組，利用限制酶進(jìn)行酶切電泳驗證，結(jié)果如下圖所示，

甲、乙、丙轉(zhuǎn)基因植株中分別被轉(zhuǎn)入了____個S基因。

（7）通過盆栽轉(zhuǎn)基因株系，分別在低磷條件下和磷正常條件下測定____以驗證轉(zhuǎn)入S基因是否能達(dá)到目的。測定結(jié)果如下圖。

結(jié)果顯示____，從而說明低磷條件下，S基因可以調(diào)控轉(zhuǎn)基因水稻對磷的吸收與積累，提高轉(zhuǎn)基因水稻產(chǎn)量。

（8）本實驗的研究價值在于____。

Answer 1

【答案】ATP、磷脂、核酸 主動運輸 逆轉(zhuǎn)錄 cDNA文庫（部分基因文庫） PCR 磷酸二酯鍵 Ca2+ 氨芐青霉素 S基因在水稻細(xì)胞中已成功表達(dá) T-DNA 染色體DNA 3、2、3 單株產(chǎn)量 磷正常條件下單株產(chǎn)量與對照組相比，沒有顯著性差異；低磷條件下，三個轉(zhuǎn)基因株系的單株產(chǎn)量均顯著高于對照組 充分挖掘植物自身高效吸收與利用磷素的磷轉(zhuǎn)運蛋白，從根本上緩解低磷脅迫對包括水稻在內(nèi)的作物影響，從而實現(xiàn)低投入、高產(chǎn)出、少污染的農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要的意義

【解析】

基因工程的基本操作程序：

1、目的基因的獲�。�
（1）目的基因是指： 編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因。
（2）獲取方法：①從基因文庫中獲取；②人工合成（反轉(zhuǎn)錄法和化學(xué)合成法）；③PCR技術(shù)擴增目的基因。

2、基因表達(dá)載體的構(gòu)建:
（1）目的：使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳至下一代，使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。
（2）組成：目的基因+啟動子+終止子+標(biāo)記基因。
①啟動子：是一段有特殊結(jié)構(gòu)的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，能驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，最終獲得所需的蛋白質(zhì)。
②終止子：也是一段有特殊結(jié)構(gòu)的DNA片段，位于基因的尾端。
③標(biāo)記基因的作用：是為了鑒定受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基因的細(xì)胞篩選出來。常用的標(biāo)記基因是抗生素基因。
（3）基因表達(dá)載體的構(gòu)建過程：


3、將目的基因?qū)�入受體細(xì)胞:
（1）轉(zhuǎn)化的概念：是目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過程。
（2）常用的轉(zhuǎn)化方法：常用方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、顯微注射技術(shù)、Ca2+處理法。
（3）重組細(xì)胞導(dǎo)入受體細(xì)胞后，篩選含有基因表達(dá)載體受體細(xì)胞的依據(jù)是標(biāo)記基因是否表達(dá)。

4、目的基因的檢測和表達(dá)：
（1）首先要檢測轉(zhuǎn)基因生物的染色體DNA上是否插入了目的基因，方法是采用DNA分子雜交技術(shù)。
（2）其次還要檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出mRNA，方法是用標(biāo)記的目的基因作探針與mRNA雜交。
（3）最后檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)，方法是從轉(zhuǎn)基因生物中提取蛋白質(zhì)，用相應(yīng)的抗體進(jìn)行抗原--抗體雜交。
（4）有時還需進(jìn)行個體生物學(xué)水平的鑒定。如轉(zhuǎn)基因抗蟲植物是否出現(xiàn)抗蟲性狀。

（1）細(xì)胞中含磷的物質(zhì)有核酸、ATP、磷脂；故磷是構(gòu)成核酸、ATP、磷脂等物質(zhì)的重要組成元素。細(xì)胞通過逆濃度梯度吸收磷，因此植物從土壤中吸收磷的方式是主動運輸。

（2）RNA經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA，用限制酶處理后與載體結(jié)合并轉(zhuǎn)入受體菌體內(nèi)，建立番茄的cDNA文庫（部分基因文庫），從cDNA文庫中獲取目的基因S。S基因兩端沒有限制酶識別序列，通過PCR技術(shù)添加相應(yīng)序列并擴增。已知Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)錄方向為順時針，通過圖示中重組質(zhì)粒分析，插入目的基因的左側(cè)所用的限制性酶是BamHI，右側(cè)所用的限制性酶是HindIII，再通過表格中限制性酶切割的具體堿基序列，結(jié)合S基因的堿基序列，可知擴增結(jié)束后，大多數(shù)DNA片段的堿基對序列：

。

（3）限制酶催化斷裂的是磷酸二酯鍵。將重組Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌時，可以用Ca2+處理農(nóng)桿菌，使農(nóng)桿菌處于感受態(tài)。一個基因表達(dá)載體的組成，除了目的基因外，還必須有啟動子和終止子，啟動子位于基因的首端，終止子位于基因的尾端：。

（4）重組質(zhì)粒中有標(biāo)記基因--氨芐青霉素抗性基因，故為了篩選出成功導(dǎo)入表達(dá)載體的農(nóng)桿菌和水稻愈傷組織，培養(yǎng)基中都需要加入氨芐青霉素。

（5）圖示中可以看出，重組質(zhì)粒含GUS(β-葡糖苷酸酶)基因，GUS(β-葡糖苷酸酶)基因的產(chǎn)物能催化無色物質(zhì)K呈現(xiàn)藍(lán)色，根據(jù)這一特性。經(jīng)無色物質(zhì)K處理愈傷組織并篩選出了呈現(xiàn)藍(lán)色的組織，說明S基因在水稻細(xì)胞中已成功表達(dá)。

（6）農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒上的T-DNA序列，可以從農(nóng)桿菌中轉(zhuǎn)移并隨機插入到被侵染植物細(xì)胞的染色體DNA中。轉(zhuǎn)基因株系甲、乙、丙進(jìn)行陽性檢測試驗結(jié)果，通過實驗結(jié)果看出，甲道出現(xiàn)3個條帶，乙道出現(xiàn)2個條帶，丙道出現(xiàn)3個條帶，故甲、乙、丙轉(zhuǎn)基因植株中分別被轉(zhuǎn)入了3、2、3個S基因。

（7）通過柱形圖的縱軸可知，通過盆栽轉(zhuǎn)基因株系，分別在低磷條件下和磷正常條件下測定單株產(chǎn)量相對值以驗證轉(zhuǎn)入S基因是否能達(dá)到目的。測定結(jié)果顯示磷正常條件下單株產(chǎn)量與對照組相比，沒有顯著性差異；低磷條件下，三個轉(zhuǎn)基因株系的單株產(chǎn)量均顯著高于對照組，從而說明低磷條件下，S基因可以調(diào)控轉(zhuǎn)基因水稻對磷的吸收與積累，提高轉(zhuǎn)基因水稻產(chǎn)量。

（8）本實驗的研究價值在于充分挖掘植物自身高效吸收與利用磷素的磷轉(zhuǎn)運蛋白，從根本上緩解低磷脅迫對包括水稻在內(nèi)的作物影響，從而實現(xiàn)低投入、高產(chǎn)出、少污染的農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要的意義。