Question

【題目】正常細(xì)胞不能合成干擾素，但含有干擾素基因。我國科學(xué)家釆用基因工程技術(shù)生產(chǎn)干擾素a-2b已實現(xiàn)量產(chǎn)。具體做法是將產(chǎn)生干擾素的人白細(xì)胞的mRNA分離，反轉(zhuǎn)錄得到干擾素基因。將含有四環(huán)素、氨芐青霉素抗性基因的質(zhì)粒PBR322和干擾素基因進(jìn)行雙酶切，用連接酶連接。將重組載體DNA分子在一定條件下導(dǎo)入大腸桿菌，在培養(yǎng)基中篩選培養(yǎng)，檢測干擾素的表達(dá)量，選出高效表達(dá)的工程菌。請回答：

（1）在分化誘導(dǎo)因子作用下，正常細(xì)胞可以擺脫抑制、合成干擾素，該過程發(fā)生的實質(zhì)是________________________________

（2）據(jù)下圖分析，構(gòu)建重組載體DNA分子時，可以選用_____兩種限制酶對質(zhì)粒pBR322和干擾素基因進(jìn)行雙酶切，目的是既能保證目的基因和質(zhì)粒正向連接，又能防止_____________________________(答兩點)。

（3）將重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌中，然后將細(xì)菌涂布到含_____的選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)，就可得到含質(zhì)粒PBR322或重組質(zhì)粒的細(xì)菌單菌落；再從每一個單菌落中挑取部分細(xì)菌轉(zhuǎn)涂到含有_____的培養(yǎng)基上，不能生長的絕大部分是含有重組質(zhì)粒的細(xì)菌，原因是_____

（4）干擾素在體外保存非常困難，如果將其分子中的一個半胱氨酸變成絲氨酸，在-70°C 條件下可以保存半年。實現(xiàn)這一轉(zhuǎn)變需要直接對_____進(jìn)行修飾或改造，這屬于蛋白質(zhì)工程的范疇。

Answer 1

【答案】基因的選擇性表達(dá) 酶B、酶C 質(zhì)粒與目的基因自身環(huán)化；防止同時破壞質(zhì)粒中的兩個標(biāo)記基因 氨芐青霉素 四環(huán)素 目的基因的插入破壞了四環(huán)素抗性基因，重組質(zhì)粒上只含有氨芐青霉素抗性基因，而質(zhì)粒上含氨芐青霉素抗性基因和四環(huán)素抗性基因，在含有四環(huán)素的培養(yǎng)基上，導(dǎo)入重組質(zhì)粒的細(xì)菌不能生長，而只導(dǎo)入質(zhì)粒的細(xì)菌能生長 基因

【解析】

1、基因表達(dá)載體的組成：目的基因、啟動子、終止子、標(biāo)記基因等。標(biāo)記基因可便于目的基因的鑒定和篩選。

2、由于不同限制酶識別的堿基序列不同，所以在切割質(zhì)粒和目的基因時常用雙酶切，可防止目的基因反向粘連和質(zhì)粒自行環(huán)化。

（1）細(xì)胞分化的實質(zhì)是基因選擇性表達(dá)，故在分化誘導(dǎo)因子作用下，正常細(xì)胞可以擺脫抑制、合成干擾素，該過程發(fā)生的實質(zhì)是基因的選擇性表達(dá)。

（2）標(biāo)記基因可用于鑒定目的基因是否導(dǎo)入受體細(xì)胞，所以重組質(zhì)粒上至少要保留一個標(biāo)記基因，由于兩個標(biāo)記基因上均含有酶A的切點，所以不能用酶A切割，為了防止連接時目的基因和質(zhì)粒自身環(huán)化，故在構(gòu)建重組載體DNA分子時，可以選用酶B和酶C兩種限制酶對質(zhì)粒pBR322和干擾素基因進(jìn)行雙酶切。

（3）由于質(zhì)粒和重組質(zhì)粒上都含有氨芐青霉素抗性基因，而未導(dǎo)入質(zhì)粒的細(xì)菌不含有該抗性基因，所以將重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌中，然后將細(xì)菌涂布到含氨芐青霉素的選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)，就可得到含質(zhì)粒PBR322或重組質(zhì)粒的細(xì)菌單菌落；由于目的基因的插入破壞了四環(huán)素抗性基因，重組質(zhì)粒上只含有氨芐青霉素抗性基因，而質(zhì)粒上含有氨芐青霉素抗性基因和四環(huán)素抗性基因，因此再從前面培養(yǎng)基上獲得的每一個單菌落中挑取部分細(xì)菌轉(zhuǎn)涂到含有四環(huán)素的培養(yǎng)基上，不能生長的絕大部分是含有重組質(zhì)粒的細(xì)菌。

（4）蛋白質(zhì)工程是通過基因修飾或基因合成，對現(xiàn)有蛋白質(zhì)進(jìn)行改造的一項技術(shù)。