Question

【題目】諾如病毒是一種單鏈RNA 病毒，可引起流行性急性腸胃炎的重要病原體。諾如病毒衣殼P蛋白上含有抗原位點(diǎn)和受體識(shí)別位點(diǎn)，在體外可單獨(dú)表達(dá)，被用于疫苗的免疫實(shí)驗(yàn)研究。

（1）人體感染諾如病毒后，會(huì)引發(fā)_______免疫，在康復(fù)者血清中能夠檢測(cè)到_________（物質(zhì)）。有研究表明感染后第 180 天記憶B細(xì)胞仍具有持久性，說(shuō)明這些細(xì)胞對(duì)機(jī)體具有___________作用。

（2）研究人員希望借P蛋白治療由β蛋白沉積導(dǎo)致的阿爾茨海默癥，選取β蛋白作為免疫原，利用諾如病毒P顆粒作為疫苗載體，研究其免疫原性。研究人員將β蛋白基因插入P蛋白基因的恰當(dāng)位置，制備了重組P蛋白基因P-β（1780bp）后，采用雙酶切方法，通過(guò)NdeⅠ和XhoⅠ酶和pET載體質(zhì)粒（5230bp）構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-P-β，如圖1。對(duì)照組應(yīng)選用___________。

①諾如病毒RNA ②P蛋白基因與pET載體質(zhì)粒構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET-P ③pET載體質(zhì)粒

（3）為了鑒定重組質(zhì)粒pET-P-β是否構(gòu)建成功，NdeⅠ和XhoⅠ酶分別對(duì)重組質(zhì)粒pET-P-β和pET載體質(zhì)粒進(jìn)行酶切，然后酶切片段和重組P蛋白基因進(jìn)行電泳，請(qǐng)將你判斷的電泳結(jié)果畫(huà)到表中對(duì)應(yīng)的泳道上。

7000bp 4000bp 1000bp
DNA標(biāo)記	P-β	pET	pET-P-β

_______

（4）想要獲得目的蛋白，需要將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET-P-β、pET-P和pET分別轉(zhuǎn)入用________處理的成為感受態(tài)的大腸桿菌細(xì)胞，培養(yǎng)處理后提取蛋白質(zhì)。過(guò)程如下：

若干健康小鼠隨機(jī)分為3組，將提取的蛋白質(zhì)分別溶于PBS緩沖液，對(duì)小鼠進(jìn)行皮下免疫，并對(duì)4次免疫后的血清進(jìn)行不同梯度稀釋，用__________（β蛋白/P蛋白）作為抗原，通過(guò)免疫法檢測(cè)重組P-β蛋白的免疫原性。如圖2所示，請(qǐng)據(jù)圖描述出能夠表明P-β蛋白可以在小鼠體內(nèi)引起免疫反應(yīng)，具有特異的免疫原性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果____________。

Answer 1

【答案】特異性免疫（體液免疫） 抗體 潛在的長(zhǎng)期保護(hù)（預(yù)防再次感染） ②③ Ca2+（CaCl2） β蛋白 在不同稀釋度條件下，P-β蛋白組的吸光度值均明顯高于PBS組和P蛋白組，PBS組和P蛋白組區(qū)別較小

【解析】

基因工程技術(shù)的基本步驟：

（1）目的基因的獲取：方法有從基因文庫(kù)中獲取、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增和人工合成。

（2）基因表達(dá)載體的構(gòu)建：是基因工程的核心步驟，基因表達(dá)載體包括目的基因、啟動(dòng)子、終止子和標(biāo)記基因等。

（3）將目的基因?qū)�入受體細(xì)胞：根據(jù)受體細(xì)胞不同，導(dǎo)入的方法也不一樣。將目的基因?qū)�入植物�?xì)胞的方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因?qū)�入�?dòng)物細(xì)胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因?qū)�入微生物�?xì)胞的方法是感受態(tài)細(xì)胞法。

（4）目的基因的檢測(cè)與鑒定：分子水平上的檢測(cè)：①檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA是否插入目的基因--DNA分子雜交技術(shù)；②檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA--分子雜交技術(shù)；③檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)--抗原-抗體雜交技術(shù)。個(gè)體水平上的鑒定：抗蟲(chóng)鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等。

（1）人體感染諾如病毒后，機(jī)體受到抗原的刺激會(huì)引發(fā)特異性免疫，在康復(fù)患者的血清中產(chǎn)生特異性抗體。記憶細(xì)胞能相對(duì)持久的識(shí)別相同的抗原，避免相同抗原再次入侵對(duì)機(jī)體的損害，說(shuō)明記憶細(xì)胞對(duì)機(jī)體具有潛在的長(zhǎng)期保護(hù)作用。

（2）采用雙酶切法獲得了重組質(zhì)粒pET-P-β，為了研究β蛋白的免疫原性，依據(jù)單一變量的原則，對(duì)照組應(yīng)該是P蛋白基因與pET載體質(zhì)粒構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET-P和pET載體質(zhì)粒，即②③。

（3）根據(jù)題干信息，重組P蛋白基因P-β為1780bp，pET載體質(zhì)粒為5230bp，用NdeⅠ和XhoⅠ酶酶切重組質(zhì)粒pET-P-β能獲得P-β和pET兩個(gè)片段，因此p-β酶切電泳后出現(xiàn)一條帶，位置是1780bp，PET酶切電泳后出現(xiàn)一條帶，位置是5230bp、PETp-β酶切后出現(xiàn)兩條帶，位置分別是1780bp和5230bp，具體的圖示結(jié)果如下：

（4）將基因表達(dá)載體導(dǎo)入大腸桿菌之前，要將大腸桿菌放入一定濃度的CaCl2溶液中處理，使之成為感受態(tài)的細(xì)胞。本題欲研究β蛋白的免疫原性，因此免疫后的血清進(jìn)行不同梯度稀釋后，用β蛋白作為抗原，通過(guò)免疫法檢測(cè)重組P-β蛋白的免疫原性。據(jù)圖2結(jié)果顯示，在不同稀釋度條件下，P-β蛋白組的吸光度值均明顯高于PBS組和P蛋白組，PBS組和P蛋白組區(qū)別較小。