Question

ch1L基因是藍藻擬核DNA上與葉綠素合成有關(guān)的基因。為研究該基因?qū)θ~綠素合成的控制，需要構(gòu)建該種生物缺失ch1L基因的變異株細(xì)胞。構(gòu)建過程如下：

第①步：用PCR技術(shù)從藍藻環(huán)狀DNA中擴增出ch1L基因片段。

第②步：將ch1L基因與質(zhì)粒構(gòu)建形成重組質(zhì)粒1。

第③步：將重組質(zhì)粒1中ch1L基因中部0.8kb片段刪除，用一段紅霉素抗性基因取代之，得到重組質(zhì)粒2。

第④步：將重組質(zhì)粒2導(dǎo)入藍藻細(xì)胞，由于改造后的基因與ch1L基因仍有很長的序列相同，所以能準(zhǔn)確地與其發(fā)生同源重組，產(chǎn)生出缺失ch1L基因的突變株。請根據(jù)上述資料，回答下列問題：

（1）第①步用PCR技術(shù)擴增DNA片段時用到的耐高溫的酶通常是指什么酶？         。

PCR擴增DNA時必須加入引物，引物的實質(zhì)是          ，其作用是                                。

（2）利用PCR技術(shù)擴增DNA一般要經(jīng)過三十多次循環(huán)，每次循環(huán)都要經(jīng)過三個步驟，其中“復(fù)性”這一步驟發(fā)生的變化是                   。為消除PCR擴增過程當(dāng)中外源DNA污染造成的影響，應(yīng)如何設(shè)置對照？                       。

（3）構(gòu)建重組質(zhì)粒1、2時，為保證成功率，往往使用                        酶

對基因和質(zhì)粒進行切割，以切出相同的黏性末端，便于連接。此酶的作用是將DNA分子的              鍵打開。

（4）質(zhì)粒是基因工程中最常用的運載體，其化學(xué)本質(zhì)是         ，此外還可用噬菌體、動植物病毒作用為運載體。

（5）導(dǎo)入重組質(zhì)粒2以后，往往還需要進行檢測和篩選，可用            制成探針，檢測是否導(dǎo)入了重組基因，在培養(yǎng)基中加入              可將變異株細(xì)胞篩選出來。

Answer 1

（1）TaqDNA聚合酶    一小段DNA或RNA   與模板結(jié)合，使DNA聚合酶從引物3’端延伸DNA鏈

（2）引物通過堿基互補與DNA模板鏈結(jié)合    對照組不加DNA模板，其它條件相同

（3）同一種DNA限制性內(nèi)切酶   磷酸二酯鍵

（4）小型環(huán)狀DNA

（5）紅霉素抗性基因     紅霉素

解析:

（1）DNA聚合酶催化DNA復(fù)制過程；引物一般為一小段單鏈DNA，新的DNA單鏈將接在引物后延伸。

（2）PCR分三步：第一是變性，主要是DNA雙鏈解開，第二是退火，也稱復(fù)性，主要是引物與DNA單鏈結(jié)合，第三是延伸，主要是新的DNA單鏈延伸。通過對照，說明問題，如果不加DNA模板仍有新DNA產(chǎn)生，說明有外源DNA污染。

（3）注意用同一種限制性內(nèi)切酶，才能切出相同的黏性末端，從而才能相連；注意限制性內(nèi)切酶破壞的是磷酸二酯鍵，不是氫鍵。

（4）了解質(zhì)粒本質(zhì)。

（5）因為重組質(zhì)粒中含有紅霉素抗性基因，所以可用紅霉素抗性基因制成探針，讓探針與重組質(zhì)粒中含有紅霉素抗性基因發(fā)生雜交。在含有紅霉素的培養(yǎng)基中，如果細(xì)菌仍能生存，說明導(dǎo)入了重組基因。