Question

8．多聚半乳糖醛酸酶（PG）能降解果膠使細(xì)胞壁破損．番茄果實(shí)成熟中，PG合成顯著增加，能使果實(shí)變紅變軟，但不利于保鮮．利用基因工程的方法減少PG基因的表達(dá)，可延長(zhǎng)果實(shí)保質(zhì)期．科學(xué)家將PG基因反向接到Ti質(zhì)粒上，導(dǎo)入到番茄細(xì)胞中，得到轉(zhuǎn)基因番茄．請(qǐng)據(jù)圖1回答：
（1）提取目的基因
①若已獲取PG的mRNA，可通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄（或cDNA文庫(kù)）獲取PG基因．
②在該基因上游加結(jié)構(gòu)A可確�；�因的反向轉(zhuǎn)錄，結(jié)構(gòu)A上應(yīng)具有RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)．得到的目的基因兩側(cè)需人工合成BamHI黏性末端．已知BamHI的識(shí)別序列如圖2-甲所示，請(qǐng)?jiān)谌鐖D2-乙相應(yīng)位置上，畫(huà)出目的基因兩側(cè)的黏性末端．
③重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中的目的是大量復(fù)制目的基因（克隆目的基因）．
（2）用含目的基因的農(nóng)桿菌感染番茄原生質(zhì)體后，可用含有卡那霉素的培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，與此同時(shí)，為能更好地達(dá)到培養(yǎng)目的，還需在培養(yǎng)基中加入植物激素（生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素）．培養(yǎng)24～48h后取樣，在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%的蔗糖溶液中，觀察細(xì)胞是否發(fā)生質(zhì)壁分離現(xiàn)象來(lái)鑒別細(xì)胞壁是否再生．
（3）由于導(dǎo)入的目的基因能轉(zhuǎn)錄反義RNA，且能與天然PG基因轉(zhuǎn)錄的mRNA互補(bǔ)結(jié)合，抑制PG基因的正常表達(dá)．若轉(zhuǎn)基因番茄的保質(zhì)期比非轉(zhuǎn)基因番茄長(zhǎng)，則可確定轉(zhuǎn)基因番茄成功．
（4）獲得的轉(zhuǎn)基因番茄產(chǎn)生的種子不一定保留目的基因，科研人員常采用植物組織培養(yǎng)方法使子代保持轉(zhuǎn)基因的優(yōu)良性狀．

Answer 1

分析 分析流程圖：圖示表示轉(zhuǎn)基因番茄的培育過(guò)程，在PG基因上游加結(jié)構(gòu)A以確保基因的反向轉(zhuǎn)錄，再構(gòu)建基因表達(dá)載體，通過(guò)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法，將目的基因?qū)�入番茄原生質(zhì)體，培養(yǎng)使之再生出細(xì)胞壁，再用植物組織培養(yǎng)技術(shù)使子代保持轉(zhuǎn)基因的優(yōu)良性狀．

解答 解：（1）①已獲取PG的mRNA，可通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄或cDNA文庫(kù)的方法獲得目的基因．
②因轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物是mRNA，在轉(zhuǎn)錄時(shí)需要RNA聚合酶．根據(jù)限制酶BamHI的識(shí)別序列和切割位點(diǎn)可知，目的基因兩側(cè)的黏性末端如圖：

③重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中的目的是大量復(fù)制目的基因（克隆目的基因）．
（2）由圖可知，標(biāo)記基因是卡那霉素基因，因此用含目的基因的農(nóng)桿菌感染番茄原生質(zhì)體后，可用含有卡那霉素的培養(yǎng)基進(jìn)行篩選．將轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞培育成轉(zhuǎn)基因植物需要采用植物組織培養(yǎng)技術(shù)，為能更好地達(dá)到培養(yǎng)目的，需在培養(yǎng)基中加入植物激素（生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素）．植物細(xì)胞在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%的蔗糖溶液中會(huì)發(fā)生質(zhì)壁分離現(xiàn)象，這可以用來(lái)鑒別細(xì)胞壁是否再生．
（3）反義RNA一般是指與編碼鏈或有義鏈互補(bǔ)的DNA鏈編碼的RNA，mRNA是由編碼鏈或有義鏈編碼的RNA，所以反義RNA和mRNA分子能互補(bǔ)成雙鏈的RNA．由于核糖體不能翻譯雙鏈的RNA，所以反義RNA與mRNA特異性的互補(bǔ)結(jié)合，即抑制了該mRNA的翻譯；若轉(zhuǎn)基因番茄的保質(zhì)期比非轉(zhuǎn)基因番茄長(zhǎng)，則可確定轉(zhuǎn)基因番茄成功．
（4）獲得的轉(zhuǎn)基因番茄產(chǎn)生的種子（是有性生殖的后代，會(huì)發(fā)生性狀分離）不一定保留目的基因，故要保持該優(yōu)良性狀，可采用無(wú)性生殖即植物組織培養(yǎng)的方法．
故答案為：
（1）①逆轉(zhuǎn)錄（或cDNA文庫(kù)）
②RNA聚合酶
③大量復(fù)制目的基因（克隆目的基因）
（2）卡那霉素      植物激素（生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素）    是否發(fā)生質(zhì)壁分離
（3）天然PG基因轉(zhuǎn)錄的mRNA     長(zhǎng)
（4）植物組織培養(yǎng)

點(diǎn)評(píng) 本題結(jié)合轉(zhuǎn)基因番茄形成的流程圖，考查基因工程、植物組織培養(yǎng)等知識(shí)，要求考生掌基因工程的原理和具體操作步驟，認(rèn)真分析轉(zhuǎn)基因番茄形成的流程圖，理解轉(zhuǎn)基因番茄的保質(zhì)期時(shí)間長(zhǎng)的原因，再答題．需要注意的是第（3）題，還要求考生明確質(zhì)壁分離的應(yīng)用，可以用于判斷植物細(xì)胞是否再生出細(xì)胞壁．