Question

【題目】嗜熱菌可以生活在98℃的高溫環(huán)境中，研究發(fā)現其耐熱性與基因H的表達產物有關。下圖表示某研究小組利用大腸桿菌對H基因實行的克隆和表達過程，其中NdeⅠ、EcoRⅠ、HindⅢ、SalⅠ四種限制酶的識別序列和酶切位點分別為CA↓TATG、G↓AATTC、A↓AGCTT、G↓TCGAC。請分析回答：

（1）圖中的結構A是_______，其主要作用是_____________________。一個完整的基因表達載體組成，除了質粒1中所示結構以外，還應該含有_____________________。

（2）用圖中質粒1和H基因構建重組質粒，應選用________________兩種限制酶進行切割，影響限制酶處理效果的因素可能有___________（多選）。

①反應溫度 ②緩沖液pH ③限制酶的濃度 ④DNA樣品的純度

（3）實驗中發(fā)現，重組質粒導入大腸桿菌后H基因的表達效率很低，但在含有質粒2（輔助性質粒）的細胞中，H基因可以高效表達。為了篩選出轉入了兩種質粒的受體菌，應在篩選平板培養(yǎng)基中添加___________，整個實驗過程應保持_________操作。

（4）PCR反應中引物的設計非常關鍵，據圖分析，擴增H基因時應選擇的一對引物是_________。

A．引物Ⅰ：…GGGAATTC…；引物Ⅱ：…CTCATATG…

B．引物Ⅰ：…GAATTCCC…；引物Ⅱ：…CATATGAG…

C．引物Ⅰ：…GGAAGCTT…；引物Ⅱ：…AAGCTTCC…

D．引物Ⅰ：…CTCATATG…；引物Ⅱ：…AAGCTTAAGCTT…

Answer 1

【答案】 啟動子 提供RNA聚合酶特異性識別結合位點 目的基因、終止子（和復制原點） NdeⅠ、EcoRⅠ ①②③④ 抗生素A和抗生素B 無菌 AB

【解析】試題分析：本題結合基因結構圖和運載體結構圖，考查基因工程的技術和原理，重點是限制酶和DNA連接酶，要求學生認真分析題圖，能根據圖中信息選擇合適的限制酶，準確判斷使用DNA連接酶連接的結果，再運用所學的知識答題。解答本題的關鍵是熟記并理解基因工程的基本操作程序并形成清晰的知識網絡。

（1）據題圖分析，由質粒1的結構、及質粒1和重組質粒上都具有A可推知，A是啟動子，其作用是提供RNA聚合酶特異性識別結合位點，驅動基因轉錄。一個完整的基因表達載體組成包括啟動子、終止子、目的基因和標記基因，而質粒1中已經含有啟動子和標記基因（抗生素A抗性基因），故答案是目的基因、終止子。

（2）結合四種限制酶的識別序列和酶切位點，確定用圖中質粒1和H基因構建重組質粒，應選用NdeⅠ、EcoRⅠ兩種限制酶進行切割，影響酶的因素都影響限制酶的處理效果，所以可能有溫度、PH、酶濃度和底物的純度，即①②③④。

（3）對兩種質粒的標記基因進行分析后可知，質粒1上含有抗生素A的抗性基因，質粒2上含有抗生素B的抗性基因，所以應在篩選平板培養(yǎng)基中添加抗生素A和抗生素B。根據微生物的培養(yǎng)條件可知整個實驗過程應保持無菌操作。

（4）分析切割質粒和目的基因的兩種限制酶NdeⅠ、EcoRⅠ的識別序列和切割位點，發(fā)現AB選項的引物Ⅱ中有NdeⅠ的識別序列CA↓TATG，而AB選項的引物Ⅰ中都有EcoRⅠ的識別序列G↓AATTC，而CD中都不含，所以應選擇AB。