Question

【題目】基因工程乙肝疫苗是乙肝表面抗原（HBsAg）亞單位疫苗，制作過程是采用現(xiàn)代生物技術(shù)將乙肝病毒表達(dá)表面抗原的基因進(jìn)行質(zhì)粒構(gòu)建，將其導(dǎo)入CHO細(xì)胞（中國倉鼠卵巢細(xì)胞）中，通過培養(yǎng)這種CHO細(xì)胞來表達(dá)乙肝表面抗原亞單位，從而獲得疫苗，基本流程如圖所示。請回答下列問題。

（1）要獲取HBsAg基因，除圖中方法外，還可以根據(jù)表面抗原蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)推測______，進(jìn)而推測目的基因的脫氧核苷酸序列，再進(jìn)行人工合成。

（2）圖中①過程選用的限制酶是_____________，理由是________________________。

（3）利用PCR技術(shù)擴(kuò)增HBsAg基因片段的前提條件是______________________________，以便合成引物。以下是某同學(xué)設(shè)計(jì)的一組引物（只標(biāo)注了部分堿基序列）：

該組引物是否合理________，理由是_____________。

（4）若一個(gè)HBsAg基因通過PCR擴(kuò)增了4次，在子代基因中同時(shí)含有兩個(gè)引物的基因占_____________。

（5）HBsAg基因在CHO細(xì)胞中表達(dá)需要有特異性的______________，控制基因表達(dá)的起始時(shí)間和表達(dá)程度。HBsAg基因能否在CHO細(xì)胞中穩(wěn)定遺傳的關(guān)鍵是____________________________。

Answer 1

【答案】氨基酸序列 HindⅢ和XhoⅠ HBsAg基因含有限制酶HindⅢ、SamⅠ和XhoⅠ的切割位點(diǎn)，但限制酶SamⅠ的切割位點(diǎn)位于目的基因上，若選用限制酶SmaⅠ則會破壞目的基因。 要有一段已知目的基因的核苷酸序列 否（不合理） 引物Ⅱ自身折疊后會出現(xiàn)局部堿基互補(bǔ)配對，這影響了與模板的堿基互補(bǔ)配對 啟動子 CHO細(xì)胞的DNA上是否插入了HBsAg基因

【解析】

基因工程技術(shù)的基本步驟：（1）目的基因的獲�。悍椒ㄓ袕幕�因文庫中獲取、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增和人工合成。（2）基因表達(dá)載體的構(gòu)建：是基因工程的核心步驟，基因表達(dá)載體包括目的基因、啟動子、終止子和標(biāo)記基因等。（3）將目的基因?qū)�入受體細(xì)胞：根據(jù)受體細(xì)胞不同，導(dǎo)入的方法也不一樣。將目的基因?qū)�入植物�?xì)胞的方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因?qū)�入動物�?xì)胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因?qū)�入微生物�?xì)胞的方法是感受態(tài)細(xì)胞法。（4）目的基因的檢測與鑒定：分子水平上的檢測：①檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA是否插入目的基因：DNA分子雜交技術(shù)；②檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA：分子雜交技術(shù)；③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)：抗原——抗體雜交技術(shù)。個(gè)體水平上的鑒定：抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等。圖示過程為利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因，①過程構(gòu)建基因表達(dá)載體，②過程導(dǎo)入受體細(xì)胞。

（1）獲取目的基因除了圖中方法外，還可以根據(jù)表面抗原蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)推測氨基酸序列，進(jìn)而推測目的基因的脫氧核苷酸序列，再進(jìn)行人工合成。

（2）根據(jù)圖示目的基因和載體上的限制酶切點(diǎn)，含有目的基因（HBsAg基因）的外源DNA分子中含有限制酶HindⅢ、SamⅠ和XhoⅠ的切割位點(diǎn)，但其中限制酶SamⅠ的切割位點(diǎn)位于目的基因上，若選用限制酶SmaⅠ則會破壞目的基因，為了保證目的基因的完整性，因此過程①用到的限制酶是HindⅢ和XhoⅠ。

（3）利用PCR技術(shù)擴(kuò)增HBsAg基因片段，其前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根據(jù)這一序列合成引物。設(shè)計(jì)的引物是與相對應(yīng)的模板連結(jié)合，但圖片中的引物Ⅱ自身折疊后會出現(xiàn)局部堿基互補(bǔ)配對，這影響了與模板的堿基互補(bǔ)配對，所以不合理。

（4）目的基因擴(kuò)增4次后共得到16個(gè)DNA分子，除了含有模板DNA鏈的2個(gè)DNA分子外，其余的子代基因中同時(shí)含有兩個(gè)引物，因此在子代基因中同時(shí)含有兩個(gè)引物的基因占。

（5）啟動子是基因的一個(gè)組成部分，控制基因表達(dá)（轉(zhuǎn)錄）的起始時(shí)間和表達(dá)的程度。目的基因能否在受體細(xì)胞中穩(wěn)定遺傳的關(guān)鍵是轉(zhuǎn)基因生物的DNA上是否插入了目的基因，即HBsAg基因能否在CHO細(xì)胞中穩(wěn)定遺傳的關(guān)鍵是：CHO細(xì)胞的DNA上是否插入了HBsAg基因。