Question

11．利用基因工程技術(shù)培育轉(zhuǎn)基因抗凍番茄，該過程需要用多種限制酶，如圖依次表示EcoR I、Sma I、Nae I三種限制酶的識別序列及切割位點(diǎn)，

請回答：
（1）上述限制酶在特定位點(diǎn)切割DNA，其實(shí)質(zhì)是斷開DNA分子每條鏈中特定部位的兩個(gè)核苷酸之間的
磷酸二酯鍵，切割后產(chǎn)生了黏性末端和平末端末端．
（2）利用EcoR I 和Nae I酶切得某種魚的抗凍蛋白基因，可與被EcoR I 和Sam I酶切后的質(zhì)料連接成重組質(zhì)料，原因是相同的黏性末端之間可連接，且不同的平末端之間也可以連接．
（3）重組質(zhì)粒導(dǎo)入番茄后，欲檢測抗凍蛋白基因是否轉(zhuǎn)錄出mRNA，需利用標(biāo)記的含有目的基因的DNA片段（或“標(biāo)記的抗凍蛋白基因”或“標(biāo)記的含有目的基因的DNA單鏈”）作探針．
（4）利用抗凍蛋白制備出相應(yīng)的抗體，然后進(jìn)行抗原-抗體雜交，觀察到雜交帶出現(xiàn)，尚不足以確定轉(zhuǎn)基因抗凍番茄培育是否成功．因此，還應(yīng)將轉(zhuǎn)基因番茄置于寒冷環(huán)境培養(yǎng)（或進(jìn)行個(gè)體水平檢測或進(jìn)行抗凍實(shí)驗(yàn)），以確定其耐寒能力是否提高．
（5）應(yīng)用PCR擴(kuò)增目的基因時(shí)，需要在基因組數(shù)據(jù)庫中查詢目的基因的核苷酸（或脫氧核苷酸或堿基）序列，以便合成引物．PCR過程第一輪循環(huán)的模板是目的基因的兩條脫氧核苷酸鏈（或目的基因）．

Answer 1

分析 1、基因工程的工具：
（1）限制酶：能夠識別雙鏈DNA分子的某種特定核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷裂．
（2）DNA連接酶：連接的是兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵．
（3）運(yùn)載體：常用的運(yùn)載體：質(zhì)粒、噬菌體的衍生物、動(dòng)植物病毒．
2、基因工程技術(shù)的基本步驟：
（1）目的基因的獲取：方法有從基因文庫中獲取、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增和人工合成．
（2）基因表達(dá)載體的構(gòu)建：是基因工程的核心步驟，基因表達(dá)載體包括目的基因、啟動(dòng)子、終止子和標(biāo)記基因等．
（3）將目的基因?qū)�入受體細(xì)胞：根據(jù)受體細(xì)胞不同，導(dǎo)入的方法也不一樣．將目的基因?qū)�入植物�?xì)胞的方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因?qū)�入�?dòng)物細(xì)胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因?qū)�入微生物�?xì)胞的方法是感受態(tài)細(xì)胞法．
（4）目的基因的檢測與鑒定：分子水平上的檢測：①檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA是否插入目的基因--DNA分子雜交技術(shù)；②檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA--分子雜交技術(shù)；③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)--抗原-抗體雜交技術(shù)．個(gè)體水平上的鑒定：抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等．

解答 解：（1）限制酶能夠識別雙鏈DNA分子的某種特定的核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開，產(chǎn)生黏性末端和平末端．
（2）EcoRⅠ酶切出粘性末端，SmaⅠ和NaeⅠ酶切出平末端，利用EcoRⅠ和NAE酶切得某種魚的抗凍蛋白基因，可與被EcoRⅠ和SamⅠ酶切后的質(zhì)粒連接成重組質(zhì)粒，原因是相同的黏性末端之間可連接，且不同的平末端之間也可以連接．
（3）欲檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出mRNA，需利用標(biāo)記的含有目的基因的DNA片段作探針，進(jìn)行核酸分子雜交，若出現(xiàn)雜交帶，說明目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA．
（4）利用抗凍蛋白制備出相應(yīng)的抗體，然后進(jìn)行抗原-抗體雜交，觀察到雜交帶出現(xiàn)，尚不足以確定轉(zhuǎn)基因抗凍番茄培育是否成功．因此，還應(yīng)進(jìn)行個(gè)體生物學(xué)水平的鑒定，將轉(zhuǎn)基因番茄置于寒冷環(huán)境培養(yǎng)，以確定其耐寒能力是否提高．
（5）應(yīng)用PCR擴(kuò)增目的基因時(shí)，需要在基因組數(shù)據(jù)庫中查詢目的基因的核苷酸（或脫氧核苷酸或堿基）序列，以便合成引物．PCR過程第一輪循環(huán)的模板是目的基因的兩條脫氧核苷酸鏈（或目的基因）．
故答案為：
（1）磷酸二酯鍵     黏性末端和平末端
（2）相同的黏性末端之間可連接，且不同的平末端之間也可以連接
（3）標(biāo)記的含有目的基因的DNA片段（或“標(biāo)記的抗凍蛋白基因”或“標(biāo)記的含有目的基因的DNA單鏈”） 
（4）抗體      置于寒冷環(huán)境培養(yǎng)（或進(jìn)行個(gè)體水平檢測或進(jìn)行抗凍實(shí)驗(yàn)）
（5）核苷酸（或脫氧核苷酸或堿基）       目的基因的兩條脫氧核苷酸鏈（或目的基因）

點(diǎn)評 本題考查了基因工程的有關(guān)知識，要求考生能夠掌握基因工程的操作步驟，識記基因工程的操作工具及作用，能夠結(jié)合圖示以及所學(xué)知識準(zhǔn)確答題，難度適中．