Question

【題目】鈣依賴蛋白激酶（CDPK）在植物的信號傳導和提高植物抗性方面發(fā)揮著重要作用，科學家通過將CDPK基因導入擬南芥中，來獲得具有抗性的新品種。下圖為某種質粒表達載體和含CDPK基因的DNA片段示意圖，圖中標記了限制酶的切割位點�；卮鹣铝袉栴}。

（1）基因工程中所用的目的基因可以人工合成，也可以從基因文庫中獲得�；�因文庫包括_______________，為了使CDPK基因插入質粒中，應選取________________兩種限制性核酸內切酶分別切割質粒和含目的基因的DNA片段。

（2）將獲取的CDPK基因進行PCR擴增，目前在PCR反應中使用Taq酶而不使用大腸桿菌DNA聚合酶主要原因是_____________________________________。

（3）圖中所示的質粒為Ti質粒，操作過程中需要把CDFK基因插入到質粒的T-DNA片段中，T-DNA片段在轉化中的作用是____________________________。為了檢測CDPK基因是否導入成功，可以用________________________________作探針檢測CDPK基因是否導入擬南芥細胞，導入成功的標志是________________ 。

（4）為研究CDPK基因表達載體對擬南芥的遺傳轉化的影響，將轉化后的擬南芥植株生長成熟后，采集其種子，播種于含________________________的MS培養(yǎng)基中進行抗性篩選。

（5）基因工程的核心是_________________ ，目的是 ____________________________。

Answer 1

【答案】基因組文庫和cDNA文庫 XbaⅠ和SmalⅠ Taq酶熱穩(wěn)定性高，而大腸桿菌DNA聚合酶在高溫下會失活 T-DNA片段能攜帶CDPK基因整合到受體細胞的染色體DNA上 放射性同位素標記的含有CDPK基因的DNA片段 顯示出雜交帶 卡那霉素 基因表達載體的構建 使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時使目的基因能夠表達和發(fā)揮作用

【解析】

基因工程技術的基本步驟：
（1）目的基因的獲�。悍椒ㄓ袕幕�因文庫中獲取、利用PCR技術擴增和人工合成。
（2）基因表達載體的構建：是基因工程的核心步驟，基因表達載體包括目的基因、啟動子、終止子和標記基因等。
（3）將目的基因導入受體細胞：根據受體細胞不同，導入的方法也不一樣。將目的基因導入植物細胞的方法有農桿菌轉化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因導入動物細胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因導入微生物細胞的方法是感受態(tài)細胞法。
（4）目的基因的檢測與鑒定：分子水平上的檢測：①應用DNA分子雜交技術檢測轉基因生物染色體的DNA是否插入目的基因；②應用分子雜交技術檢測目的基因是否轉錄出了mRNA；③應用抗原-抗體雜交技術檢測目的基因是否翻譯成蛋白質。個體水平上的鑒定：抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等。

（1）基因文庫包括基因組文庫和cDNA文庫，為了使CDPK基因插入質粒中，選擇XbaⅠ和SmalⅠ能夠將目的基因完整切下，并且在質粒的T-DNA片段中也有切點，而HindⅢ會影響目的基因的完整度，EcoRⅠ會破壞標記基因。
（2）將獲取的CDPK基因進行PCR擴增，目前在PCR反應中使用Taq酶而不使用大腸桿菌DNA聚合酶主要原因是Taq酶熱穩(wěn)定性高，而大腸桿菌DNA聚合酶在高溫下會失活。
（3）圖中所示的質粒為Ti質粒，操作過程中需要把CDFK基因插入到質粒的T-DNA片段中，T-DNA片段在轉化中的作用是T-DNA片段能攜帶CDPK基因整合到受體細胞的染色體DNA上；為了檢測CDPK基因是否導入成功，可以用放射性同位素標記的含有CDPK基因的DNA片段作探針檢測CDPK基因是否導入擬南芥細胞，導入成功的標志是顯示出雜交帶。
（4）為研究CDPK基因表達載體對擬南芥的遺傳轉化的影響，將轉化后的擬南芥植株生長成熟后，采集其種子，播種于含卡那霉素的MS培養(yǎng)基中進行抗性篩選，能成活的植株就是成功轉基因的擬南芥植株。
（5）基因工程的核心是基因表達載體的構建 ，目的是使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時使目的基因能夠表達和發(fā)揮作用。