Question

【題目】金屬硫蛋白(MT)是一類廣泛存在的金屬結(jié)合蛋白，某研究小組計(jì)劃通過多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增獲得目的基因，構(gòu)建轉(zhuǎn)基因工程菌，用于重金屬廢水的凈化處理。PCR擴(kuò)增過程示意圖如下，請(qǐng)回答下列問題：

（1）設(shè)計(jì)一對(duì)與MT基因兩端序列互補(bǔ)配對(duì)的引物(引物1和引物2)，為方便構(gòu)建重組質(zhì)粒，在引物中需要增加適當(dāng)?shù)?/span>______________位點(diǎn)。設(shè)計(jì)引物時(shí)需要避免引物之間形成______________，而造成引物自連。

（2）圖中步驟1代表______________，步驟2代表退火，步驟3代表延伸，這三個(gè)步驟組成一輪循環(huán)。

（3）PCR擴(kuò)增時(shí)，退火溫度的設(shè)定是成敗的關(guān)鍵。退火溫度過高會(huì)破壞引物與模板之間的堿基配對(duì)。退火溫度的設(shè)定與引物長(zhǎng)度、堿基組成有關(guān)，長(zhǎng)度相同但____________的引物需要設(shè)定更高的退火溫度。

（4）如果PCR反應(yīng)得不到任何擴(kuò)增產(chǎn)物，則可以采取的改進(jìn)措施有_____(填序號(hào)：①升高退火溫度 ②降低退火溫度 ③重新設(shè)計(jì)引物)。

Answer 1

【答案】 限制性核酸內(nèi)切酶 堿基互補(bǔ)配對(duì) 變性 GC含量高 ②③

【解析】試題分析：圖中代表PCR技術(shù)流程，步驟1代表模板DNA在94℃的高溫下變性，步驟2代表退火，步驟3代表延伸，這三個(gè)步驟組成一輪循環(huán)。

（1）引物的作用是作為DNA復(fù)制的起點(diǎn)，由于目的基因前端插入了引物，所以在構(gòu)建重組質(zhì)粒時(shí)，要在引物中增加適當(dāng)?shù)南拗菩院怂醿?nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，保證目的基因完整地插入到重組質(zhì)粒中；設(shè)計(jì)引物時(shí)要注意避免引物之間堿基互補(bǔ)配對(duì)，形成環(huán)狀DNA，使其無法插入重組質(zhì)粒中。

（2）步驟1所示模板DNA在94℃的高溫下變性，使DNA斷開雙鏈結(jié)構(gòu)。

（3）PCR的退火過程中，進(jìn)行的是引物與模板鏈的結(jié)合，如果溫度過高，會(huì)破壞引物與模板鏈之間的堿基配對(duì)；由于堿基之間是以氫鍵連接的，堿基A與T之間以兩個(gè)氫鍵連接，堿基C與G之間以三個(gè)氫鍵連接，相比之下C與G之間穩(wěn)定性更高，所以長(zhǎng)度相同但堿基G與C含量高的引物需要設(shè)定更高的退火溫度。

（4）如果PCR反應(yīng)得不到任何擴(kuò)增產(chǎn)物，則說明退火過程出現(xiàn)問題，由于退火溫度過高導(dǎo)致引物與模板鏈無法結(jié)合，或是由于引物設(shè)計(jì)的不合理，使其無法和模板鏈互補(bǔ)結(jié)合。