Question

【題目】下面是將乙肝病毒控制合成病毒表面主蛋白的基因HBsAg導入巴斯德畢赤酵母菌生產乙肝疫苗的過程及有關資料，請分析回答下列問題：

資料1：巴斯德畢赤酵母菌是一種甲基營養(yǎng)型酵母菌，能將甲醇作為其唯一碳源。當其在甲醇中培養(yǎng)時，AOX1基因受到誘導而表達[5′AOX1和3′AOX1(TT)分別是基因AOX1的啟動子和終止子]。

資料2：巴斯德畢赤酵母菌體內無天然質粒，所以科學家改造出了圖1所示的pPIC9K質粒用作載體，其與目的基因形成的重組質粒經酶切后可以與酵母菌染色體發(fā)生同源重組，將目的基因整合于染色體中以實現(xiàn)表達。

資料3：限制酶酶切位點

(1)如果要將HBsAg基因和pPIC9K質粒重組，應該在HBsAg基因兩側的A和B位置接上限制酶_________________的識別序列，這樣設計的目的是__________________________。

(2)酶切獲取HBsAg基因后，需用________將其連接到pPIC9K質粒上，形成重組質粒。

(3)步驟3中應選用限制酶________來切割重組質粒獲得重組DNA，然后將其導入巴斯德畢赤酵母菌細胞。

(4)為了確認巴斯德畢赤酵母菌轉化是否成功，在培養(yǎng)基中應該加入卡拉霉素以便篩選，轉化后的細胞中是否含有HBsAg基因，可以用______________________方法進行檢測。

(5)轉化后的酵母菌在培養(yǎng)基上培養(yǎng)一段時間后，需要向其中加入________以維持其生活，同時誘導HBsAg基因表達。

(6)與大腸桿菌等細菌相比，用巴斯德畢赤酵母菌細胞作為基因工程的受體細胞，其優(yōu)點是_______________________________________________________。

Answer 1

【答案】 SnaBⅠ和AvrⅡ 用兩種限制酶對質粒和目的基因同時切割，可以防止目的基因和質粒發(fā)生自身環(huán)化（并且能將目的基因插在啟動子和終止子之間） DNA連接酶 BglⅡ DNA分子雜交 甲醇 酵母菌為真核生物，具有內質網(wǎng)和高爾基體等細胞器，能夠對蛋白質進行加工，而細菌沒有各種細胞器(除了核糖體)，不形成分泌蛋白

【解析】【試題分析】

本題考查基因工程應用的關知識，意在考查學生對相關知識的理解和掌握情況，對圖表的分析判斷能力。有利于培養(yǎng)學生搜集和處理科學信息的能力、思維能力、分析和解決問題的能力。分析題圖：圖中質粒上含有SnaB、AvrⅡ、BglⅡ和SacI限制酶切割位點，其中SacI位于啟動子上，SnaBⅠ、AvrⅡ識別的序列在啟動子與終止子之間，要將HBsAg基因和pPIC9K質粒重組，只能用限制酶SnaB和AvrⅡ切割質粒。要獲取含有5′AOX1--3′AOX1段基因，應選用限制酶BglⅡ來切割。

（1）重組質粒上的目的基因若要表達，需要目的基因的首尾含有啟動子和終止子。而SnaBⅠ、AvrⅡ識別的序列在啟動子與終止子之間，只要在目的基因兩側A和B位置分別接上這兩種酶識別的序列，并用SnaBⅠ、AvrⅡ這兩種限制酶對質粒和目的基因同時切割，便會各自出現(xiàn)相同的黏性末端（或平末端），便于重組與表達，同時可防止目的基因和質粒發(fā)生自身環(huán)化。因此應該在HBsAg基因兩側的A和B位置接上限制酶SnaBⅠ和AvrⅡ的識別序列。

（2）用DNA連接酶可將切割后的HBsAg基因和pPIC9K質粒連接成重組質粒。

（3）重組DNA的兩側分別是啟動子和終止子，除BglⅡ外，其它限制酶會破壞含有啟動子、終止子的目的基因，故應該選擇限制酶BglⅡ來切割重組質粒獲得重組DNA。

（4）檢測目的基因是否成功插入到受體細胞染色體，通常用DNA分子雜交技術。

（5）巴斯德畢赤酵母菌是一種甲基營養(yǎng)型酵母菌，能將甲醇作為其唯一碳源，同時甲醇能誘導AOX1基因表達。所以轉化的酵母菌在培養(yǎng)基上培養(yǎng)一段時間后，需要向其中加入甲醇以維持其生活，同時誘導HBsAg基因表達。

（6）酵母菌為真核生物，細胞內具有對分泌蛋白加工的內質網(wǎng)和高爾基體等細胞器，細菌等原核生物，不具有內質網(wǎng)和高爾基體等細胞器，不能形成分泌蛋白，所以生產乙肝疫苗的過程中，與大腸桿菌等細菌相比，巴斯德畢赤酵母菌細胞更適合作為受體細胞。