Question

【題目】單克隆抗體在診斷和治療中具有廣泛的應(yīng)用。已知一般細(xì)胞的DNA合成途徑有起始合成途徑和中間合成途徑兩種，氨基蝶呤（A）可以阻礙起始合成途經(jīng)，次黃嘌呤（H）及胸腺嘧啶核苷（T）則是中間合成途徑所必需的物質(zhì)。骨髓瘤細(xì)胞只有起始合成途徑。在HAT培養(yǎng)基中含有次黃嘌呤（H）、氨基蝶呤（A）及胸腺嘧啶核苷（T）。下面是制備單克隆抗體的基本步驟：

步驟1：對(duì)小鼠多次注射特定抗原，制備淋巴細(xì)胞。

步驟2：細(xì)胞融合與雜交瘤細(xì)胞的選擇性培養(yǎng)。最后一次免疫后第3天制備脾細(xì)胞懸液；篩選出？途徑缺失的骨髓瘤細(xì)胞，于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（又稱(chēng)指數(shù)生長(zhǎng)期，即細(xì)胞以指數(shù)形式增加）制備骨髓瘤細(xì)胞懸液；取適量的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行混合，對(duì)它們進(jìn)行誘導(dǎo)融合處理；用HAT培養(yǎng)基對(duì)處理后的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。

步驟3：二次篩選。

步驟4：大規(guī)模培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞，批量生產(chǎn)單克隆抗體。

回答下列問(wèn)題：

（1）步驟1中對(duì)小鼠多次注射特定抗原的目的是________________________；實(shí)驗(yàn)所需淋巴細(xì)胞可由________________細(xì)胞增殖分化而來(lái)。

（2）于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期制備骨髓瘤細(xì)胞懸液的原因是________________________________；為使HAT培養(yǎng)基上只有雜交瘤細(xì)胞可以存活，步驟2中應(yīng)填________。

（3）步驟3中二次篩選可通過(guò)________________________法進(jìn)行目的抗體的檢測(cè)，篩選出________________細(xì)胞。

（4）在體外對(duì)雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行克隆化培養(yǎng)時(shí)，為維持無(wú)菌無(wú)毒的環(huán)境，應(yīng)進(jìn)行的操作是_______________________________________________________________________。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在雜交瘤細(xì)胞的體外培養(yǎng)過(guò)程中，加入飼養(yǎng)層細(xì)胞比不加的生長(zhǎng)要好，可能的原因是________________________________________。

Answer 1

【答案】增加相應(yīng)B淋巴細(xì)胞的數(shù)量 B細(xì)胞和記憶 對(duì)數(shù)期的細(xì)胞增殖速率較快 中間合成 抗原—抗體雜交 目的抗體檢驗(yàn)呈陽(yáng)性的雜交瘤（能夠分泌目的抗體的雜交瘤） 對(duì)培養(yǎng)液和所有培養(yǎng)用具進(jìn)行無(wú)菌處理，在培養(yǎng)液中加入一定量的抗生素、定期更換培養(yǎng)液 飼養(yǎng)層細(xì)胞可以產(chǎn)生一些促生長(zhǎng)因子

【解析】

1.動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)條件

（1）無(wú)菌、無(wú)毒的環(huán)境：對(duì)培養(yǎng)液和所有培養(yǎng)用具進(jìn)行無(wú)菌處理，通常還要在培養(yǎng)液中加入一定量的的抗生素，以防被污染。此外應(yīng)定期更換培養(yǎng)液，以便清除代謝產(chǎn)物防止細(xì)胞代謝產(chǎn)物累積對(duì)細(xì)胞自身產(chǎn)生危害；

（2）營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)：無(wú)機(jī)物(無(wú)機(jī)鹽、微量元素等)，有機(jī)物(糖、氨基酸、促生長(zhǎng)因子等)血清和血漿 (提供細(xì)胞生長(zhǎng)必須的營(yíng)養(yǎng)成份)；

（3）溫度和pH(36.5±0.5℃，7.2~7.4)；

（4）氣體環(huán)境(95%的空氣+5%CO2的混合氣體)其中5%CO2氣體是為保持培養(yǎng)液的pH穩(wěn)定。

2.單克隆抗體制備的原理：

B淋巴細(xì)胞在抗原的刺激下，能夠增殖、分化形成分泌特定抗體的效應(yīng)B細(xì)胞。B細(xì)胞的這種能力和量是有限的，不可能持續(xù)分化增殖下去，因此產(chǎn)生免疫球蛋白的能力也是極其微小的。將這種B細(xì)胞與非分泌型的骨髓瘤細(xì)胞融合形成雜交瘤細(xì)胞，再進(jìn)一步克隆化，這種雜交瘤細(xì)胞既能無(wú)限增殖，又能分泌特異性抗體，將這種克隆化的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)或注入小鼠體內(nèi)即可獲得大量的高效價(jià)、單一的特異性抗體。這種技術(shù)即稱(chēng)為單克隆抗體技術(shù)。

（1）制備單克隆抗體的前提是首先獲得效應(yīng)B細(xì)胞，為了獲得更多的相應(yīng)的B淋巴細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)中需要對(duì)小鼠多次注射特定抗原；實(shí)驗(yàn)所需的效應(yīng)B細(xì)胞可由B細(xì)胞和記憶細(xì)胞在抗原的刺激下增殖分化而來(lái)。

（2）因?yàn)樘幱趯?duì)數(shù)期的細(xì)胞增殖速率較快，適應(yīng)新的培養(yǎng)環(huán)境的能力強(qiáng)，因此選擇處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期制備骨髓瘤細(xì)胞懸液用于實(shí)驗(yàn)；一般細(xì)胞的DNA合成途徑有起始合成途徑和中間合成途徑兩種，而骨髓瘤細(xì)胞只有起始途徑，為了將雜交瘤細(xì)胞選出來(lái)，在步驟2中應(yīng)選擇中間合成途徑缺失的骨髓瘤細(xì)胞，在HAT培養(yǎng)基上雜交瘤細(xì)胞能利用效應(yīng)B細(xì)胞的中間途徑進(jìn)行增殖。因?yàn)樵?/span>HAT培養(yǎng)基中阻斷了DNA合成的起始途徑，骨髓瘤細(xì)胞以及骨髓瘤細(xì)胞自融的細(xì)胞因?yàn)槠鹗纪緩奖蛔钄喽鵁o(wú)法增殖。效應(yīng)B細(xì)胞以及效應(yīng)B細(xì)胞互融的細(xì)胞沒(méi)有增殖能力。

（3）步驟3中二次篩的目的是要篩選出能產(chǎn)生特定抗體的雜交瘤細(xì)胞，通常可根據(jù)抗原抗體能夠發(fā)生特異性結(jié)合的方法來(lái)檢測(cè)，即用抗原—抗體雜交法進(jìn)行目的抗體的檢測(cè)，從而將能夠分泌目的抗體的雜交瘤細(xì)胞篩選出來(lái)。

（4）動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)需要在無(wú)菌、無(wú)毒的環(huán)境中進(jìn)行，因此，在體外對(duì)雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行克隆化培養(yǎng)時(shí)，需要對(duì)培養(yǎng)液和所有培養(yǎng)用具進(jìn)行無(wú)菌處理，并同時(shí)在培養(yǎng)液中加入一定量的抗生素以維持無(wú)菌、無(wú)毒環(huán)境，具體培養(yǎng)過(guò)程中還需要定期更換培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在雜交瘤細(xì)胞的體外培養(yǎng)過(guò)程中，加入飼養(yǎng)層細(xì)胞比不加的生長(zhǎng)要好，根據(jù)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的條件可知，加入飼養(yǎng)層細(xì)胞生長(zhǎng)好的可能原因是飼養(yǎng)層細(xì)胞可以產(chǎn)生一些促生長(zhǎng)因子。