Question

【題目】圖 1 是某基因工程中構(gòu)建重組質(zhì)粒的過(guò)程示意圖，載體 質(zhì)粒 P0 具有四環(huán)素 抗性基因（tetr）和氨芐青霉素抗性基因（ampr）。請(qǐng)回答下列問(wèn)題：

（1）EcoR V 酶切位點(diǎn)為，EcoR V 酶切出來(lái)的線性載體 P1 為__________未端。

（2）用 Taq DNA 聚合酶進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增獲得的目的基因片段，其兩端各自帶有一個(gè)腺 嘌呤脫氧核苷酸。載體 P1 用酶處理，在兩端各添加了一個(gè)堿基為___________ 的 脫氧核苷酸，形成 P2；P2 和目的基因片段在__________酶作用下，形成重組質(zhì) 粒 P3。

（3）為篩選出含有重組質(zhì)粒 P3 的菌落，采用含有不同抗生素的平板進(jìn)行篩選，得到 A、B、C 三類(lèi)菌落，其生長(zhǎng)情況如下表（“+”代表生長(zhǎng)，“﹣”代表不生長(zhǎng)）。根據(jù)表 中結(jié)果判斷，應(yīng)選擇的菌落是_____（填表中字母）類(lèi)，另外兩類(lèi)菌落質(zhì)粒導(dǎo)入情況分別是_____、___________________。

菌落類(lèi)型 平板類(lèi)型	A	B	C
無(wú)抗生素	﹢	﹢	﹢
氨芐青霉素	﹢	﹢	﹣
四環(huán)素	﹢	﹣	﹣
氨芐青霉素+四環(huán)素	﹢	﹣	﹣

（4）為鑒定篩選出的菌落中是否含有正確插入目的基因的重組質(zhì)粒，擬設(shè)計(jì)引物進(jìn)行 PCR 鑒定。圖 2 所示為甲、乙、丙 3 條引物在正確重組質(zhì)粒中的相應(yīng)位置，PCR 鑒定時(shí)應(yīng)選擇的一對(duì)引物是____________。某學(xué)生嘗試用圖中另外一對(duì)引物從某一 菌落的質(zhì)粒中擴(kuò)增出了 400 bp 片段，原因是_______________。

Answer 1

【答案】平 胸腺嘧啶(T) DNA連接 B A類(lèi)菌落含有PO C類(lèi)菌落未轉(zhuǎn)入質(zhì)粒 乙丙 目的基因反向連接

【解析】

基因表達(dá)載體的基本結(jié)構(gòu)包括復(fù)制原點(diǎn)、目的基因、標(biāo)記基因、啟動(dòng)子、終止子等。根據(jù)題干信息和圖形分析，P0是載體質(zhì)粒，其含有的氨芐青霉素抗性基因（ampr）和四環(huán)素抗性基因（tetr）都屬于標(biāo)記基因，可以用檢測(cè)目的基因是否導(dǎo)入受體細(xì)胞；EcoRV酶為限制酶，其切割質(zhì)粒后悔破壞了四環(huán)素抗性基因（tetr）。

（1）根據(jù)題意分析，EcoRV 酶識(shí)別的序列是-GATATC-，并且兩條鏈都在中間的T與A之間進(jìn)行切割，因此其切出來(lái)的線性載體P1為平末端。

（2）據(jù)圖分析，目的基因兩側(cè)為粘性末端，且漏出的堿基為A，則在載體P1的兩端需要個(gè)加一個(gè)堿基T形成具有粘性末端的載體P2，再用DNA連接酶將P2與目的基因連接起來(lái)形成重組質(zhì)粒P3

（3）根據(jù)以上分析已知，限制酶切割后破壞了四環(huán)素抗性基因，但是沒(méi)有破壞氨芐青霉素抗性基因，因此含有重組質(zhì)粒P3的菌落在四環(huán)素中應(yīng)該不能生長(zhǎng)，而在氨芐青霉素的培養(yǎng)基中能生長(zhǎng)，結(jié)合表格分析可知，應(yīng)該選擇B類(lèi)菌落。根據(jù)表格分析，A類(lèi)菌落在氨芐青霉素和四環(huán)素的培養(yǎng)基中都能夠生長(zhǎng)，說(shuō)明其導(dǎo)入的是P0； C類(lèi)菌落在任何抗生素的培養(yǎng)基中都不能生長(zhǎng)，說(shuō)明其沒(méi)有導(dǎo)入任何質(zhì)粒。

（4）據(jù)圖分析，根據(jù)目的基因插入的位置和PCR技術(shù)的原理分析，PCR 鑒定時(shí)應(yīng)該選擇的一對(duì)引物是乙和丙：根據(jù)題意和圖形分析，某同學(xué)用圖中的另外一對(duì)引物(甲、乙)從某一菌落的質(zhì)粒中擴(kuò)增出了400bp的片段，說(shuō)明其目的基因發(fā)生了反向連接。