Question

【題目】釀酒酵母不能利用木糖制約了利用植物原料生產(chǎn)乙醇的經(jīng)濟(jì)效益。木酮糖激酶是木糖轉(zhuǎn)化、利用的關(guān)鍵酶，為提高酵母細(xì)胞中木酮糖激酶的表達(dá)量，科研人員將兩種啟動(dòng)子與木酮糖激酶基因結(jié)合并導(dǎo)入釀酒酵母細(xì)胞，構(gòu)建能同時(shí)利用葡萄糖和木糖的重組釀酒酵母。下左圖表示相關(guān)研究過(guò)程，右表是幾種限制性內(nèi)切酶的識(shí)別序列及切割位點(diǎn)。請(qǐng)回答：

限制酶	識(shí)別序列和
切割位點(diǎn)
EcoRⅠ	G↓AATTC
BamHⅠ	G↓GATCC
HindⅢ	A↓AGCTT
XhoⅠ	C↓TCGAG
NdeⅠ	CA↓TATG
SalⅠ	G↓TCGAC

　　

(1)重組質(zhì)粒中終止子的作用是____。表中切割DNA后形成相同黏性末端的限制性內(nèi)切酶是____，黏性末端為____。

(2)過(guò)程③使用的限制性內(nèi)切酶是________。過(guò)程⑤需先用LiAc處理釀酒酵母細(xì)胞，其目的是__________，使細(xì)胞處于能吸收環(huán)境中DNA的狀態(tài)。

(3)結(jié)合圖示分析，進(jìn)行工程菌篩選時(shí)，在含四環(huán)素的培養(yǎng)基上長(zhǎng)出的菌落不一定是導(dǎo)入重組質(zhì)粒的釀酒酵母，這是因?yàn)?/span>____________。

(4)研究人員對(duì)篩選得到的兩種重組酵母(甲中導(dǎo)入啟動(dòng)子A，乙中導(dǎo)入啟動(dòng)子B)細(xì)胞中木酮糖激酶活力及發(fā)酵乙醇得率進(jìn)行比較(發(fā)酵條件：1 L 15 g·L－1的葡萄糖和50 g·L－1的木糖培養(yǎng)基中，120 h)結(jié)果如下表。

從木酮糖激酶酶活力分析，可以得出的結(jié)論是啟動(dòng)子A的功能比啟動(dòng)子B____，但本實(shí)驗(yàn)中乙醇得率相差不大，其可能的原因是___________________________________________。

Answer 1

【答案】使轉(zhuǎn)錄終止(或使RNA聚合酶與模板分離) XhoⅠ與SalⅠ —AGCT(或TCGA—) EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ 增大酵母細(xì)胞的通透性 普通質(zhì)粒上有抗四環(huán)素基因，導(dǎo)入普通質(zhì)粒的酵母也能在含四環(huán)素的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)繁殖 弱 實(shí)驗(yàn)中發(fā)酵時(shí)間過(guò)長(zhǎng)(或培養(yǎng)基中的葡萄糖和木糖含量過(guò)少)

【解析】

基因表達(dá)載體的組成：目的基因+啟動(dòng)子+終止子+標(biāo)記基因，其中啟動(dòng)子是RNA聚合酶特異性識(shí)別和結(jié)合的DNA序列，是基因的一個(gè)組成部分，控制基因表達(dá)（轉(zhuǎn)錄）的起始時(shí)間和表達(dá)的程度；終止子是給予RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)的DNA序列。

（1）重組質(zhì)粒的組成成分包括啟動(dòng)子、終止子、目的基因和標(biāo)記基因，其中終止子的作用是使轉(zhuǎn)錄終止；根據(jù)表格分析，不同的限制酶識(shí)別和切割的位點(diǎn)不同，其中XhoⅠ與SalⅠ切割DNA后形成黏性末端是相同的，都是—AGCT(或TCGA—)。

（2）據(jù)圖分析，過(guò)程③含有啟動(dòng)子A的目的基因兩側(cè)的限制酶切割位點(diǎn)是EcoRⅠ、BamHⅠ，且質(zhì)粒上也有這兩種限制酶切割位點(diǎn)，而且沒(méi)有破壞標(biāo)記基因，因此過(guò)程③使用的限制性內(nèi)切酶是EcoRⅠ、BamHⅠ；過(guò)程⑤需先用LiAc處理釀酒酵母細(xì)胞，增大了酵母細(xì)胞的通透性，使細(xì)胞處于能吸收環(huán)境中DNA的狀態(tài)。

（3）由于重組質(zhì)粒和普通質(zhì)粒上都有抗四環(huán)素基因，則導(dǎo)入普通質(zhì)粒的酵母和導(dǎo)入重組質(zhì)粒的酵母菌都能在含四環(huán)素的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)繁殖，因此在含四環(huán)素的培養(yǎng)基上長(zhǎng)出的菌落不一定是導(dǎo)入重組質(zhì)粒的釀酒酵母。

（4）根據(jù)表格數(shù)據(jù)分析，重組釀酒酵母乙的木酮糖激酶酶活力遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于重組釀酒酵母甲的木酮糖激酶酶活力，說(shuō)明啟動(dòng)子A的功能比啟動(dòng)子B弱；但本實(shí)驗(yàn)中乙醇得率相差不大，可能是因?yàn)閷?shí)驗(yàn)中發(fā)酵時(shí)間過(guò)長(zhǎng)(或培養(yǎng)基中的葡萄糖和木糖含量過(guò)少)。