Question

10．多聚半乳糖醛酸酶（PG）能降解果膠使細胞壁破損．成熟的番茄果實中，PG合成顯著增加，能使果實變紅變軟，但不利于保鮮．利用基因工程減少PG基因的表達，可延長果實保質(zhì)期．科學(xué)家將PG基因反向接到Ti質(zhì)粒上，導(dǎo)入番茄細胞中，得到轉(zhuǎn)基因番茄，具體操作流程如圖．據(jù)圖回答下列問題：

（1）若已獲取PG的mRNA，可通過逆轉(zhuǎn)錄法方法獲取PG基因．PCR技術(shù)擴增目的基因的前提是有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根據(jù)這一序列合成引物．
（2）該質(zhì)粒含14000堿基對（14kb），若同時使用兩種限制酶切割，產(chǎn)生的片段有5kb、7.5kb、1.5kb，則只用限制酶BamHⅠ切割時產(chǎn)生的片段長度分別是7.5kb和6.5kb．
（3）用含目的基因的農(nóng)桿菌感染番茄原生質(zhì)體后，可用含有卡那霉素的培養(yǎng)基進行篩選．如果想通過實驗鑒別細胞壁是否再生，可將其置于質(zhì)量分數(shù)為30%的蔗糖溶液中，觀察細胞是否發(fā)生質(zhì)壁分離現(xiàn)象進行判斷．
（4）由于導(dǎo)入的目的基因能轉(zhuǎn)錄出反義RNA，且能與天然的PG基因轉(zhuǎn)錄的mRNA（正常的mRNA）互補結(jié)合，因此可抑制PG基因的正常表達，使番茄果實的保質(zhì)期延長．

Answer 1

分析 基因工程技術(shù)的基本步驟：
（1）目的基因的獲�。悍椒ㄓ袕幕�因文庫中獲取、利用PCR技術(shù)擴增和人工合成．
（2）基因表達載體的構(gòu)建：是基因工程的核心步驟，基因表達載體包括目的基因、啟動子、終止子和標記基因等．
（3）將目的基因?qū)�入受體細胞：根據(jù)受體細胞不同，導(dǎo)入的方法也不一樣．將目的基因?qū)�入植物細胞的方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因?qū)�入動物細胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因?qū)�入微生物細胞的方法是感受態(tài)細胞法．
（4）目的基因的檢測與鑒定：分子水平上的檢測：①檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA是否插入目的基因--DNA分子雜交技術(shù)；②檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA--分子雜交技術(shù)；③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)--抗原-抗體雜交技術(shù)．個體水平上的鑒定：抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等．

解答 解：（1）若已獲取PG的mRNA，可通過逆轉(zhuǎn)錄法獲取PG基因．PCR技術(shù)擴增目的基因的前提是有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根據(jù)這一序列合成引物．
（2）該質(zhì)粒含14000堿基對（14kb），若同時使用兩種限制酶切割，產(chǎn)生的片段有5kb、7.5kb、1.5kb，則只用限制酶BamHⅠ切割時產(chǎn)生的片段長度分別是7.5kb和5+1.5=6.5kb．
（3）由圖可知，重組質(zhì)粒中含卡那霉素抗性基因而四環(huán)素抗性基因被破壞，因此用含目的基因的農(nóng)桿菌感染番茄原生質(zhì)體后，可用含有卡那霉素的培養(yǎng)基進行篩選．之后，還需將其置于質(zhì)量分數(shù)為0.3g/ml的蔗糖溶液中，觀察細胞細胞是否發(fā)生質(zhì)壁分離現(xiàn)象來鑒別細胞壁是否再生．
（4）由于導(dǎo)入的目的基因能轉(zhuǎn)錄出反義RNA，且能與天然的PG基因轉(zhuǎn)錄的mRNA互補結(jié)合，因此可抑制PG基因的正常表達．
故答案為：
（1）逆轉(zhuǎn)錄法　有一段已知目的基因的核苷酸序列      
（2）7.5kb  6.5kb
（3）卡那霉素　是否發(fā)生質(zhì)壁分離    
（4）天然的PG基因轉(zhuǎn)錄的mRNA（正常的mRNA）

點評 本題結(jié)合轉(zhuǎn)基因番茄形成的流程圖，考查基因工程、植物組織培養(yǎng)等知識，要求考生掌基因工程的原理和具體操作步驟，認真分析轉(zhuǎn)基因番茄形成的流程圖，理解轉(zhuǎn)基因番茄的保質(zhì)期時間長的原因，能結(jié)合圖中信息準確答題．