Question

9．利用轉(zhuǎn)基因奶牛乳腺生物發(fā)生器生產(chǎn)人的生長(zhǎng)激素，需要構(gòu)建一種能高水平表達(dá)的表達(dá)載體，選擇合適的基因啟動(dòng)子至關(guān)重要．由于無(wú)法由基因表達(dá)產(chǎn)物推知啟動(dòng)子的堿基序列，運(yùn)用PCR技術(shù)單獨(dú)克隆啟動(dòng)子存在困難．科研人員經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期研究，終于發(fā)明了下圖所示的一種克隆啟動(dòng)子的方法．請(qǐng)分析回答：

請(qǐng)回答：
（1）培育轉(zhuǎn)基因奶牛時(shí)，需要在生長(zhǎng)激素編碼序列前插入乳腺蛋白基因的啟動(dòng)子．
（2）由基因表達(dá)產(chǎn)物無(wú)法推知啟動(dòng)子堿基序列，其原因是基因中啟動(dòng)子的堿基序列不能被轉(zhuǎn)錄．
（3）過(guò)程①需選擇的限制酶是BamHⅠ，過(guò)程③需選擇的限制酶是HindⅢ．過(guò)程④需要使用的工具酶是耐高溫的DNA聚合酶（Taq酶） ．
（4）過(guò)程④中可以根據(jù)編碼序列兩端的部分堿基序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行擴(kuò)增，還需提供足夠的4種脫氧核苷酸作為原料．?dāng)U增過(guò)程中，在第三輪循環(huán)產(chǎn)物中開(kāi)始出現(xiàn)兩條脫氧核苷酸鏈等長(zhǎng)的DNA片段．
（5）過(guò)程⑤中克隆的啟動(dòng)子與外源基因編碼序列連接時(shí)，原引物a所在的P片段的堿基對(duì)數(shù)目應(yīng)是3的整數(shù)倍，目的是保證外源基因編碼序列編碼正確的氨基酸序列．

Answer 1

分析 分析題圖：外源DNA分子上含有限制酶BamHⅠ、HindⅢ、MboⅠ、HindⅢ的識(shí)別序列和切割位點(diǎn)，且限制酶BamHⅠ和MboⅠ的識(shí)別序列相同，用限制酶HindⅢ、MboⅠ和HindⅢ切割都會(huì)破壞目的基因．①表示獲取目的基因的過(guò)程；②表示基因表達(dá)載體的構(gòu)建過(guò)程；③表示將基因表達(dá)載體中的目的基因切開(kāi)；④表示采用PCR技術(shù)體外擴(kuò)增目的基因．

解答 解：（1）培育轉(zhuǎn)基因奶牛時(shí)，根據(jù)基因的選擇性表達(dá)原理，需要在生長(zhǎng)激素編碼序列前插入乳腺蛋白基因的啟動(dòng)子，使生長(zhǎng)激素編碼序列只在乳腺組織細(xì)胞中表達(dá)．
（2）因?yàn)榛�因中啟�?dòng)子的堿基序列不能被轉(zhuǎn)錄，所以由基因表達(dá)產(chǎn)物無(wú)法推知啟動(dòng)子堿基序列．
（3）含有目的基因的外源DNA分子上含有限制酶BamHⅠ、HindⅢ、MboⅠ、HindⅢ的識(shí)別序列和切割位點(diǎn)，但是用限制酶HindⅢ、MboⅠ和HindⅢ切割都會(huì)破壞目的基因，所以過(guò)程①應(yīng)選擇限制酶BamHⅠ．而限制酶BamHⅠ和MboⅠ的識(shí)別序列相同，所以過(guò)程③中要將基因表達(dá)載體中的目的基因切開(kāi)，應(yīng)選擇位于目的基因上的另一個(gè)限制酶HindⅢ．過(guò)程④表示采用PCR技術(shù)體外擴(kuò)增目的基因的過(guò)程，該過(guò)程在高溫條件下進(jìn)行，因此需要使用耐高溫的DNA聚合酶（Taq酶）．
（4）過(guò)程④中可以根據(jù)基因編碼序列兩端的部分堿基序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行擴(kuò)增．PCR技術(shù)的產(chǎn)物是DNA，因此原料是四種脫氧核苷酸．PCR過(guò)程示意圖為：
．由此可見(jiàn)，擴(kuò)增過(guò)程中，在第三輪循環(huán)產(chǎn)物中開(kāi)始出現(xiàn)兩條脫氧核苷酸鏈等長(zhǎng)的DNA片段．
（5）因?yàn)榛�因中相鄰�?個(gè)堿基決定一個(gè)密碼子，所以過(guò)程⑤中將克隆的啟動(dòng)子與外源基因編碼序列連接時(shí)，原引物a所在的P片段的堿基對(duì)數(shù)目應(yīng)是3的整數(shù)倍，目的是保證外源基因編碼序列編碼正確的氨基酸序列．
故答案為：
（1）乳腺蛋白基因
（2）基因中啟動(dòng)子的堿基序列不能被轉(zhuǎn)錄
（3）BamHⅠHindⅢ耐高溫的DNA聚合酶（Taq酶）
（4）引物      脫氧核苷酸     三
（5）保證外源基因編碼序列編碼正確的氨基酸序列

點(diǎn)評(píng) 本題結(jié)合克隆啟動(dòng)子的流程圖，考查基因工程的相關(guān)知識(shí)，要求考生識(shí)記基因工程的原理及操作步驟，能正確分析圖解，并從中獲取有效信息準(zhǔn)確答題，屬于考綱理解和應(yīng)用層次的考查．