Question

【題目】利用酵母菌分解廢紙是一種環(huán)保的方式，但廢紙中的纖維素分子量大不能直接進(jìn)入酵母菌，且酵母菌無(wú)法分解利用環(huán)境中的纖維素。為解決這一難題，科學(xué)家將纖維素酶基因通過(guò)重組質(zhì)粒導(dǎo)入酵母菌。其所用質(zhì)粒及其酶切位點(diǎn)如下圖1，外源DNA上的纖維素酶基因及其酶切位點(diǎn)如圖2。請(qǐng)回答下列問(wèn)題：

（1）圖1、圖2中的質(zhì)粒和纖維素酶基因分別作為重組DNA技術(shù)中的_______，為使兩者能夠有效組合，圖中可選用的最合適的限制酶是_______。

（2）若質(zhì)粒被HindⅢ限制酶識(shí)別的序列是-AAGCTT -，并在A與A之間切割。請(qǐng)畫(huà)出被切割后所形成的黏性末端_____________。

（3）科學(xué)家進(jìn)一步構(gòu)建了含3種不同基因片段的重組質(zhì)粒，進(jìn)行了一系列的研究。下圖3是酵母菌轉(zhuǎn)化及纖維素酶在工程菌內(nèi)合成與運(yùn)輸?shù)氖疽鈭D。

①圖3中已導(dǎo)入重組質(zhì)粒的菌株有______ 。

②設(shè)置菌株Ⅰ作為對(duì)照，是為了驗(yàn)證_______均不攜帶纖維素酶基因。

③將4株菌株分別置于以纖維素為_______的培養(yǎng)基上，其中_______兩個(gè)菌株不能存活。

④據(jù)圖推測(cè)A基因片段的作用是_______。

Answer 1

【答案】運(yùn)載體和目的基因 Hind III和PstI 菌株Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ 質(zhì)粒和酵母菌 唯一碳源 菌株Ⅰ和菌株Ⅱ 使纖維素酶可以固定于細(xì)胞壁表面

【解析】

1、選擇限制酶的方法

(1)根據(jù)目的基因兩端的限制酶切點(diǎn)確定限制酶的種類(lèi)

①應(yīng)選擇切點(diǎn)位于目的基因兩端的限制酶，如圖甲可選擇PstⅠ。

②不能選擇切點(diǎn)位于目的基因內(nèi)部的限制酶，如圖甲不能選擇SmaⅠ。

③為避免目的基因和質(zhì)粒的自身環(huán)化和隨意連接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和質(zhì)粒，如圖甲也可選擇用PstⅠ和EcoRⅠ兩種限制酶(但要確保質(zhì)粒上也有這兩種酶的切點(diǎn))。

(2)根據(jù)質(zhì)粒的特點(diǎn)確定限制酶的種類(lèi)

①所選限制酶要與切割目的基因的限制酶相一致，以確保具有相同的黏性末端。

②質(zhì)粒作為載體必須具備標(biāo)記基因等，所以所選擇的限制酶盡量不要破壞這些結(jié)構(gòu)，如圖乙中限制酶SmaⅠ會(huì)破壞標(biāo)記基因；如果所選酶的切點(diǎn)不止一個(gè)，則切割重組后可能會(huì)丟失某些片段，若丟失的片段含復(fù)制起點(diǎn)區(qū)，則切割重組后的片段進(jìn)入受體細(xì)胞后將不能自主復(fù)制。

2、分析圖2可知，纖維素酶基因的兩端存在HindⅢ和PstⅠ的酶切位點(diǎn)。使用同一種限制酶切割目的基因和質(zhì)粒，容易導(dǎo)致目的基因或質(zhì)粒自身連接；纖維素酶為胞外酶，該酶在核糖體上合成，依次經(jīng)過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體加工，最后通過(guò)胞吐釋放到細(xì)胞外。

（1）根據(jù)題意可知，將纖維素酶基因通過(guò)重組質(zhì)粒導(dǎo)入酵母菌，則圖2中的纖維素酶基因?yàn)槟康幕�因，質(zhì)粒是運(yùn)載目的基因的運(yùn)載體。據(jù)圖2可知，纖維素酶基因中存在BamHⅠ的酶切位點(diǎn)，因此不能選擇BamHⅠ切割目的基因；只使用PstⅠ切割目的基因和質(zhì)粒，可能出現(xiàn)目的基因或質(zhì)粒的自身連接，因此為使纖維素酶基因能夠與質(zhì)粒有效組合，應(yīng)選用最合適的限制酶是HindⅢ和PstⅠ。

（2）質(zhì)粒被Hindlil限制酶識(shí)別的序列是一AAGCTT一，并在A與A之間切割磷酸二酯鍵，則被切割后所形成的黏性末端為和。

（3）①據(jù)圖3可知，菌株Ⅰ中導(dǎo)入的是普通質(zhì)粒，菌株Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ中導(dǎo)入的是重組質(zhì)粒。

②設(shè)置菌株I作為對(duì)照，根據(jù)其不能合成纖維素酶可判斷質(zhì)粒DNA和酵母菌基因組不攜帶纖維素酶基因。

③篩選可分泌纖維素酶的轉(zhuǎn)基因酵母菌，可將4株菌株分別置于以纖維素為唯一碳源的培養(yǎng)基上。據(jù)圖可知，菌株Ⅱ中缺少信號(hào)肽編碼序列，導(dǎo)致所產(chǎn)生的纖維素酶無(wú)法分泌到細(xì)胞外，分解細(xì)胞外的纖維素，使得細(xì)胞無(wú)可利用的碳源，由于菌株Ⅰ中導(dǎo)入的是普通質(zhì)粒，其不能合成纖維素酶，不能利用培養(yǎng)基中的碳源，因此菌株Ⅰ和菌株Ⅱ因不能利用纖維素碳源不能存活。

④識(shí)圖分析可知，圖3中菌株Ⅳ導(dǎo)入的重組質(zhì)粒中含有纖維素酶基因、A基因片段和信號(hào)肽編碼序列，其與菌株Ⅱ、Ⅲ相比可以看出，分泌的纖維素酶固定于細(xì)胞壁表面，因此推測(cè)A基因片段的作用使纖維素酶可以固定于細(xì)胞壁表面。