Question

11．科學家將魚抗凍蛋白基因轉(zhuǎn)入番茄，使番茄的耐寒能力大大提高，可以在相對寒冷的環(huán)境中生長．質(zhì)粒上有PstⅠ、SmaⅠ、HindⅢ、AluⅠ等四種限制酶切割位點，如圖是轉(zhuǎn)基因抗凍番茄培育過程的示意圖（ampr為抗氨芐青霉素基因），其中①～④是轉(zhuǎn)基因抗凍番茄培育過程中的相關(guān)步驟，Ⅰ、Ⅱ表示相關(guān)結(jié)構(gòu)或細胞．請據(jù)圖作答：

（1）利用PCR技術(shù)擴增魚的抗凍蛋白基因，向反應(yīng)的試管中添加模板DNA、四種脫氧核苷三磷酸（dNTP）、引物和熱穩(wěn)定DNA聚合酶．
（2）基因工程的核心是構(gòu)建基因表達載體，進行這項操作時，為了避免目的基因和載體在酶切后產(chǎn)生的末端發(fā)生任意連接，在此實例中，應(yīng)該選用限制酶PstⅠ、SmaⅠ同時對含魚抗凍蛋白基因的DNA和質(zhì)粒進行切割，切割后用DNA連接酶 酶處理．
（3）研究人員通常采用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將魚抗凍蛋白基因?qū)�入番茄細胞�?nèi)．在培養(yǎng)基中的添加氨芐青霉素，來篩選已導入含魚的抗凍蛋白基因的番茄細胞，篩選后，為了進一步確定是否含目的基因，用DNA分子雜交方法檢測是否有目的基因．通常采用抗原-抗體雜交技術(shù)，在分子水平檢測目的基因是否翻譯形成了相應(yīng)的蛋白質(zhì)，在這項技術(shù)中的魚的抗凍蛋白是抗原．

Answer 1

分析 分析圖解：魚的抗凍蛋白基因上具有三種限制酶切割位點，PstⅠ酶的切割位點存在于目的基因的兩側(cè)，SmaⅠ酶的切割位點存在于目的基因的左側(cè)，而AluⅠ酶的切割位點存在于目的基因的中央，因此不宜選用AluⅠ酶．質(zhì)粒上有PstⅠ、SmaⅠ、HindⅢ、AluⅠ等四種限制酶切割位點，在選擇限制酶時一般選擇同種限制酶，以便形成相同的黏性末端．圖中①～④分別表示：基因表達載體的構(gòu)建、目的基因?qū)�入受體細胞、脫分化、再分化．

解答 解：（1）利用PCR技術(shù)擴增DNA時所需的條件：引物、模板DNA、原料（4種脫氧核糖核苷酸）、引物和耐熱性的DNA聚合酶等．
（2）基因工程的核心是構(gòu)建基因表達載體，在構(gòu)建基因表達載體中，如果目的基因和載體用同一種限制酶切割，獲得的黏性末端相同，將會發(fā)生目的基因和載體在酶切后產(chǎn)生的末端發(fā)生任意連接（或目的基因自連、質(zhì)粒自連），故應(yīng)選用不同的限制酶分別對目的基因和載體切割，以獲得不同的黏性末端．由于AluⅠ酶的切割位點存在于目的基因的中央，因此不宜選用AluⅠ酶，則應(yīng)選用PstⅠ和SmaⅠ對含魚抗凍蛋白基因的DNA、質(zhì)粒進行切割．切割后用DNA連接酶處理，構(gòu)建基因表達載體．
（3）將目的基因?qū)�入植物細胞常用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法，在培養(yǎng)基中的添加氨芐青霉素，來篩選已導入含魚的抗凍蛋白基因的番茄細胞，篩選后，為了進一步確定是否含目的基因，用DNA分子雜交方法檢測是否有目的基因．在分子水平檢測目的基因是否翻譯形成了相應(yīng)的蛋白質(zhì)，通常采用抗原-抗體雜交技術(shù)，在這項技術(shù)中的魚的抗凍蛋白是抗原．
故答案為：
（1）引物   熱穩(wěn)定DNA聚合酶
（2）構(gòu)建基因表達載體   PstⅠ、SmaⅠDNA連接酶
（3）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化（或基因槍法等，答案合理即給分）  氨芐青霉素 　DNA分子雜交  抗原-抗體雜交　  抗原

點評 本題考查了基因工程的工具酶、目的基因?qū)�入受體細胞以及利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因植株的相關(guān)知識，解答的難點是能夠根據(jù)目的基因和質(zhì)粒上的切割位點選擇合適的限制酶．