Question

【題目】L-肉堿具有參與脂肪氧化、抗疲勞、延遲患阿爾茨海默綜合癥等功能。據(jù)報(bào)道大腸桿菌能將巴豆甜菜堿轉(zhuǎn)化成L-肉堿，但效率較低�？蒲腥藛T通過(guò)基因工程將BCD基因、F基因以及T基因?qū)�入到大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)以提高L-肉堿的轉(zhuǎn)化率。實(shí)驗(yàn)過(guò)程及結(jié)果如下圖所示，分析并回答下列問題：

Kan 卡那霉素抗性基因

CAT 氯霉素抗性基因

（1）實(shí)驗(yàn)過(guò)程中用PCR技術(shù)獲得目的基因，PCR反應(yīng)體系需要加入的有機(jī)物有DNA模板、dNTP、耐高溫DNA聚合酶和____________。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中不能將BCD基因、F基因以及T基因直接導(dǎo)入到大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)，而是構(gòu)建重組質(zhì)粒后再導(dǎo)入大腸桿菌，原因是____________，并能遺傳給下一代.圖中兩個(gè)重組質(zhì)粒目的基因的首端都含有啟動(dòng)子T7，T7是____________識(shí)別和結(jié)合的部位，能驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄。

（2）將重組所粒1和重組質(zhì)粒2導(dǎo)入大腸桿菌時(shí)，應(yīng)用________處理大腸桿菌，使細(xì)胞處于____________________的感受態(tài)。

（3）為了篩選出同時(shí)含有BCD基因、F基因以及T基因的大腸桿菌，實(shí)驗(yàn)的思路是______________。

（4）研究發(fā)現(xiàn)巴豆甜菜堿轉(zhuǎn)化成L-肉堿是一個(gè)可逆反應(yīng)過(guò)程，得到的工程菌在含有巴豆甜菜堿培養(yǎng)基中培養(yǎng)2小時(shí)后，L-肉堿的含量基本穩(wěn)定，此時(shí)可以____________________，使反應(yīng)向生成L-肉堿的方向進(jìn)行，以提高產(chǎn)量。

Answer 1

【答案】（兩種）引物 使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并能夠得以表達(dá)（使目的基因在受體細(xì)胞中完成轉(zhuǎn)化） RNA聚合酶 Ca2+ 易于吸收周圍環(huán)境中DNA分子 在同時(shí)含有卡那霉素和氯霉素培養(yǎng)基上挑選能生長(zhǎng)的大腸桿菌菌落 及時(shí)移除產(chǎn)物（更換培養(yǎng)液）

【解析】

基因工程技術(shù)的基本步驟：（1）目的基因的獲取：方法有從基因文庫(kù)中獲取、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增和人工合成。（2）基因表達(dá)載體的構(gòu)建：是基因工程的核心步驟，基因表達(dá)載體包括目的基因、啟動(dòng)子、終止子和標(biāo)記基因等。（3）將目的基因?qū)�入受體細(xì)胞：根據(jù)受體細(xì)胞不同，導(dǎo)入的方法也不一樣。將目的基因?qū)�入植物�?xì)胞的方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因?qū)�入�?dòng)物細(xì)胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因?qū)�入微生物�?xì)胞的方法是感受態(tài)細(xì)胞法。（4）目的基因的檢測(cè)與鑒定：分子水平上的檢測(cè)：①檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA是否插入目的基因--DNA分子雜交技術(shù)；②檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA--分子雜交技術(shù)；③檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)--抗原-抗體雜交技術(shù)；個(gè)體水平上的鑒定：抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等。

（1）多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR），是一種體外迅速擴(kuò)增DNA片段的技術(shù)，它能以極少量的DNA為模板，在幾小時(shí)內(nèi)復(fù)制出上百萬(wàn)份的DNA拷貝。它可看作是生物體外的特殊DNA復(fù)制，PCR的最大特點(diǎn)，是能將微量的DNA大幅增加。PCR反應(yīng)體系需要加入的有機(jī)物有DNA模板、dNTP、耐高溫DNA聚合酶和（兩種）引物。由于目的基因無(wú)法直接在受體細(xì)胞中表達(dá)，因此為了使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，能夠表達(dá)，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中不能將BCD基因、F基因以及T基因直接導(dǎo)入到大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)，而是構(gòu)建重組質(zhì)粒后再導(dǎo)入大腸桿菌。并能遺傳給下一代。圖中兩個(gè)重組質(zhì)粒目的基因的首端都含有啟動(dòng)子T7，T7是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，能驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄。
（2）使體外重組的DNA分子轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞內(nèi)，主要是借鑒細(xì)菌或病毒侵染細(xì)胞的途徑。一般將受體大腸桿菌用Ca2+處理，使細(xì)胞處于易于吸收周圍環(huán)境中DNA分子的感受態(tài)，使含有目的基因的重組質(zhì)粒容易進(jìn)入受體細(xì)胞。
（3）重組質(zhì)粒1上含有BCD基因、T基因及卡那霉素抗性基因，重組質(zhì)粒2上含有F基因、T基因及氯霉素抗性基因，因此在同時(shí)含有卡那霉素和氯霉素培養(yǎng)基上挑選單克隆大腸桿菌，就是同時(shí)含有BCD基因、F基因以及T基因的大腸桿菌。
（4）研究發(fā)現(xiàn)巴豆甜菜堿轉(zhuǎn)化成L-肉堿是一個(gè)可逆反應(yīng)過(guò)程，在可逆反應(yīng)中，減少生成物濃度，可使反應(yīng)向正方向進(jìn)行。因此得到的工程菌在含有巴豆甜菜堿培養(yǎng)基中培養(yǎng)2小時(shí)后，L-肉堿的含量基本穩(wěn)定，此時(shí)可以及時(shí)移除產(chǎn)物（更換培養(yǎng)液），使反應(yīng)向生成L-肉堿的方向進(jìn)行，以提高產(chǎn)量。