Question

【題目】許多大腸桿菌的質(zhì)粒上含有l(wèi)acZ基因，其編碼的產(chǎn)物β－半乳糖苷酶在X－gal和IPTG存在下，可以產(chǎn)生藍(lán)色沉淀，使菌落呈現(xiàn)藍(lán)色，否則菌落呈現(xiàn)白色。基因工程中常利用該原理從導(dǎo)入質(zhì)粒的受體細(xì)胞中篩選出真正導(dǎo)入重組質(zhì)粒的細(xì)胞，過程如下圖所示。請據(jù)圖回答：

(1)基因工程中，能使目的基因在受體細(xì)胞中特異性表達(dá)的調(diào)控序列是_______ 。

(2)限制酶EcoR Ⅰ的識別序列和切割位點(diǎn)是－G↓AATTC－，Sma Ⅰ的識別序列和切割位點(diǎn)是－CCC↓GGG－。圖中目的基因被切割下來和質(zhì)粒連接之前，需在目的基因的右側(cè)連接相應(yīng)的末端，連接的末端序列是__________，連接過程中需要的基本工具是__________。

(3)轉(zhuǎn)化過程中，大腸桿菌應(yīng)先用________處理，使其處于能吸收周圍DNA的狀態(tài)。

(4)菌落顏色為白色的是________，原因是_______________________。

(5)菌落③中的目的基因是否表達(dá)，可采用的檢測辦法是_________________。

Answer 1

【答案】 啟動子 －TTAA DNA連接酶 Ca2＋ 菌落③ lacZ標(biāo)記基因區(qū)插入外源基因后被破壞，不能表達(dá)出β－半乳糖苷酶，故菌落為白色 抗原—抗體雜交

【解析】本題主要考查基因工程的操作步驟。難點(diǎn)在于限制酶的選擇及目的基因的處理。要求學(xué)生能熟知基因工程的操作步驟，會分析限制酶作用后的粘性末端。

（1）啟動子是一段有特殊序列的DNA片段，位于目的基因的首端，它是RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，在啟動子存在時(shí)才能驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，最終獲得所需要的蛋白質(zhì)。因此在基因工程中，能使目的基因在受體細(xì)胞中特異性表達(dá)的調(diào)控序列是啟動子。

（2）由圖可知，目的基因的左側(cè)有限制酶EcoRI的識別序列，右側(cè)是限制酶Sma I的識別序列，而質(zhì)粒上只有限制酶EcoRI的識別序列，所以需要用限制酶EcoRI來切割質(zhì)粒，用限制酶EcoRI和Sma I來切割含有目的基因的外源DNA分子，這樣就使目的基因右側(cè)無法與質(zhì)粒連接，所以目的基因被切割下來和質(zhì)粒連接之前，需在目的基因的右側(cè)連接限制酶EcoRI切割形成的末端，即-TTAA，連接過程中需要DNA連接酶。

（3）將目的基因?qū)�入大腸桿菌細(xì)胞之前，應(yīng)先用Ca2+處理大腸桿菌，使其處于能吸收周圍DNA的感受態(tài)。

（4）用限制酶EcoRI切割質(zhì)粒時(shí)，會破壞質(zhì)粒上的lacZ'基因，但切割后的質(zhì)粒自身環(huán)化后，lacZ'基因又被修復(fù)，能表達(dá)產(chǎn)生B-半乳糖苷酶，在X-gal和IPTG 存在下，可以產(chǎn)生藍(lán)色沉淀，使菌落呈現(xiàn)藍(lán)色，所以菌落①②呈現(xiàn)藍(lán)色；菌落③導(dǎo)入的是重組質(zhì)粒，其lacZ'基因被破壞，不能表達(dá)產(chǎn)生B-半乳糖苷酶，在X-gal和IPTG 存在下，菌落顏色為白色。

（5）檢測目的基因是否表達(dá)產(chǎn)生蛋白質(zhì)，可采用抗原一抗體雜交法。