Question

【題目】人體內(nèi)的t-PA蛋白能高效降解由血纖維蛋白凝聚而成的血栓，是心梗和腦血栓的急救藥。然而，為心梗患者注射大劑量的基因工程t-PA會誘發(fā)顱內(nèi)出血，其原因在于t-PA與血纖維蛋白結(jié)合的特異性不高。研究證實，將t-PA第84位的半胱氨酸換成絲氨酸，能顯著降低出血副作用。據(jù)此，先對天然的t-PA基因進(jìn)行序列改造，然后再采取傳統(tǒng)的基因工程方法表達(dá)該突變基因，可制造出性能優(yōu)異的t-PA突變蛋白，該過程稱為蛋白質(zhì)工程。

（1）已知人t-PA基因第84位半胱氨酸的編碼序列（即模板鏈的互補(bǔ)鏈序列）為TGT，而絲氨酸的密碼子為UCU，因此突變基因編碼該氨基酸的編碼序列應(yīng)設(shè)計為______。

（2）上述突變基因（即目的基因）宜采用______方法獲得。

（3）若獲得的t-PA突變基因如圖1所示，那么質(zhì)粒pCLY11需用限制酶______和______切開，才能與t-PA突變基因高效連接。

（4）將連接好的DNA分子導(dǎo)入大腸桿菌中，含t-PA突變基因重組DNA分子的細(xì)胞應(yīng)具有的表型是______。

A．新霉素抗性且呈藍(lán)色 B．新霉素敏感且呈藍(lán)色

C．新霉素抗性且呈白色 D．新霉素敏感且呈白色

（5）為了收獲大腸桿菌表達(dá)的t-PA突變蛋白，第一步可采用常規(guī)的酶分離提純方法。這種方法的基本操作順序是______。

A．破碎→過濾→沉淀→層析B．過濾→層析→破碎→沉淀

C．層析→沉淀→過濾→破碎 D．沉淀→破碎→層析→過濾

（6）層析是蛋白質(zhì)或酶分離提純的重要步驟。在圖2所示的層析裝置中，層析柱內(nèi)裝填了特定的細(xì)小固體顆粒（稱為層析介質(zhì)），待分離的蛋白質(zhì)或酶混合溶液流進(jìn)流出層析柱，便可將目標(biāo)蛋白與雜蛋白高效分離。試根據(jù)題干信息判斷，為了高效分離t-PA突變蛋白，層析介質(zhì)表面事先應(yīng)交聯(lián)或固定______。

Answer 1

【答案】TCT 化學(xué)方法人工合成 XmaI BglII C A 血纖維蛋白

【解析】

1、蛋白質(zhì)工程是指以蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)規(guī)律及其生物功能的關(guān)系作為基礎(chǔ)，通過基因修飾或基因合成，對現(xiàn)有蛋白質(zhì)進(jìn)行改造，或制造一種新的蛋白質(zhì)，以滿足人類的生產(chǎn)和生活的需求。（基因工程在原則上只能生產(chǎn)自然界已存在的蛋白質(zhì)）
2、蛋白質(zhì)工程的基本途徑：從預(yù)期的蛋白質(zhì)功能出發(fā)，設(shè)計預(yù)期的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，推測應(yīng)有的氨基酸序列，找到相對應(yīng)的脫氧核苷酸序列（基因）以上是蛋白質(zhì)工程特有的途徑；以下按照基因工程的一般步驟進(jìn)行。（注意：目的基因只能用人工合成的方法）

（1）因為制造性能優(yōu)異的t-PA突變蛋白，是將t-PA第84位的半胱氨酸換成絲氨酸，已知人t-PA基因第84位半胱氨酸的編碼序列（即模板鏈的互補(bǔ)鏈序列）為TGT，而絲氨酸的密碼子為UCU，因此突變基因編碼該氨基酸的編碼序列應(yīng)設(shè)計為TCT。

（2）上述突變基因（即目的基因）由于序列較短，并且序列已知，所以宜采用化學(xué)方法人工合成。

（3）由于目的基因的兩端的堿基序列分別是CCGG、CTAG，所以應(yīng)用XmaI和BglII兩種限制酶切割，以便于把目的基因連接到質(zhì)粒pCLY11上。

（4）由圖1可知，將連接好的DNA分子導(dǎo)入大腸桿菌中，由于限制酶切割質(zhì)粒破壞了mlacZ基因，所以含t-PA突變基因重組DNA分子的細(xì)胞應(yīng)具有的表型是新霉素抗性且呈白色。

（5）為了收獲大腸桿菌表達(dá)的t-PA突變蛋白，第一步可采用常規(guī)的酶分離提純方法。這種方法的基本操作順序是破碎→過濾→沉淀→層析。

（6）為了高效分離t-PA突變蛋白，層析介質(zhì)表面事先應(yīng)交聯(lián)或固定血纖維蛋白，這樣便可將目標(biāo)蛋白與雜蛋白高效分離