Question

12．如圖是利用工程菌（大腸桿菌）生產(chǎn)人生長(zhǎng)激素（由人垂體細(xì)胞產(chǎn)生的一種蛋白質(zhì)類激素）的實(shí)驗(yàn)流程．所用的pBR322質(zhì)粒含有限制酶pasⅠ、EcoRⅠ和HindⅢ的切點(diǎn)各一個(gè)，且三種酶切割形成的黏性末端各不相同，而Amp^r表示青霉素抗性基因，Tet^r表示四環(huán)素抗性基因．請(qǐng)據(jù)圖回答以下相關(guān)問(wèn)題：

（1）過(guò)程①所用細(xì)胞是人垂體細(xì)胞，過(guò)程②所用的原料和酶分別是（四種）脫氧核苷酸、逆轉(zhuǎn)錄（反轉(zhuǎn)錄）酶．
（2）人生長(zhǎng)激素基因在經(jīng)③處理之前需經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增前需要人工合成2種引物備用，擴(kuò)增時(shí)應(yīng)在PCR擴(kuò)增儀中加入熱穩(wěn)定DNA聚合酶用以催化互補(bǔ)鏈的合成．
（3）若人生長(zhǎng)激素基因兩端具有限制酶pstⅠ識(shí)別序列，切割人生長(zhǎng)激素基因和pBR322質(zhì)粒時(shí)只用限制酶pstⅠ的目的是確保產(chǎn)生相同的黏性末端，切割時(shí)斷開(kāi)的鍵是磷酸二酯鍵．
（4）過(guò)程④所用的酶是DNA連接酶；過(guò)程⑤應(yīng)選擇對(duì)青霉素和四環(huán)素敏感型的大腸桿菌作為受體細(xì)胞，為提高轉(zhuǎn)化率，首先用Ca²⁺處理大腸桿菌使其成為感受態(tài)細(xì)胞．
（5）若用限制酶PstⅠ切割，完成過(guò)程④、⑤后，將三角瓶?jī)?nèi)的大腸桿菌先接種到甲培養(yǎng)基上，再將甲培養(yǎng)基上的單個(gè)大腸桿菌接種到丙培養(yǎng)基上，待形成12個(gè)菌落后，將相應(yīng)菌落的一部分轉(zhuǎn)接到乙培養(yǎng)基的相同位置上．一段時(shí)間后，菌落的生長(zhǎng)狀況如圖乙、丙所示．將三角瓶?jī)?nèi)的大腸桿菌接種到甲培養(yǎng)基上的目的是篩選含四環(huán)素抗性基因的大腸桿菌；接種到培養(yǎng)基乙上能存活的是導(dǎo)入含完整的pBR322質(zhì)�；蚝�有Amp^r、Tet^r的質(zhì)粒的大腸桿菌．生產(chǎn)人生長(zhǎng)激素的工程菌應(yīng)從丙培養(yǎng)基的菌落中選取，選取的依據(jù)是在丙中能存活，在乙中不能存活．

Answer 1

分析 1、分析題圖：①表示從人垂體組織細(xì)胞提取人生長(zhǎng)激素mRNA，②表示反轉(zhuǎn)錄形成cDNA，③表示獲取人的生長(zhǎng)激素基因，④表示基因表達(dá)載體的構(gòu)建，⑤表示將基因表達(dá)載體導(dǎo)入大腸桿菌．
2、與丙相比，乙培養(yǎng)基中少了兩個(gè)菌落，說(shuō)明丙培養(yǎng)基中這兩個(gè)菌落中的大腸桿菌成功導(dǎo)入了重組質(zhì)粒，而且目的基因插入質(zhì)粒后，破壞了青霉素抗性基因，但沒(méi)有破環(huán)四環(huán)素抗性基因，因此含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌能在含有四環(huán)素的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，但不能在含有青霉素的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)．

解答 解：（1）過(guò)程①表示從人垂體組織細(xì)胞提取人生長(zhǎng)激素mRNA，故所用的細(xì)胞是人垂體細(xì)胞，過(guò)程②表示反轉(zhuǎn)錄形成cDNA，故所用的原料是（四種）脫氧核苷酸，酶是逆轉(zhuǎn)錄（反轉(zhuǎn)錄）酶．
（2）采用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因需要兩種引物．PCR擴(kuò)增時(shí)需要熱穩(wěn)定DNA聚合酶的催化．
（3）若人生長(zhǎng)激素基因兩端具有限制酶pstⅠ識(shí)別序列，切割人生長(zhǎng)激素基因和pBR322質(zhì)粒時(shí)只用限制酶pstⅠ的目的是確保產(chǎn)生相同的黏性末端，切割時(shí)斷開(kāi)的鍵是磷酸二酯鍵．
（4）過(guò)程④表示基因表達(dá)載體的構(gòu)建，所用的酶是DNA連接酶；過(guò)程⑤表示將基因表達(dá)載體導(dǎo)入大腸桿菌，應(yīng)選擇對(duì)青霉素和四環(huán)素敏感型的大腸桿菌作為受體細(xì)胞．首先用Ca²⁺處理大腸桿菌使其成為感受態(tài)細(xì)胞，可以提高轉(zhuǎn)化率．
（5）在甲中能生長(zhǎng)的是具有四環(huán)素抗性的細(xì)菌，因此含有四環(huán)素抗性基因；在乙培養(yǎng)基上也能存活的大腸桿菌還含有青霉素抗性基因，即在乙培養(yǎng)基上能存活的大腸桿菌含有兩種抗性基因，因此其導(dǎo)入的是完整的pBR322質(zhì)�；蚝�有Amp^r、Tet^r的質(zhì)粒；與丙相比，乙培養(yǎng)基中少了兩個(gè)菌落，說(shuō)明丙培養(yǎng)基中這兩個(gè)菌落中的大腸桿菌成功導(dǎo)入了重組質(zhì)粒，而且目的基因插入質(zhì)粒后，破壞了青霉素抗性基因，使含有目的基因的大腸桿菌不能在含有青霉素的乙培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，但四環(huán)素基因是完好的，即含有目的基因的大腸桿菌能在含有四環(huán)素的丙培養(yǎng)基上生長(zhǎng)．
故答案為：
（1）人垂體細(xì)胞          （四種）脫氧核苷酸、逆轉(zhuǎn)錄（反轉(zhuǎn)錄）酶
（2）2     熱穩(wěn)定DNA聚合酶
（3）相同的黏性末端         磷酸二酯鍵
（4）DNA連接酶       對(duì)青霉素和四環(huán)素敏感        Ca²⁺
（5）四環(huán)素抗性        完整的pBR322質(zhì)�；蚝�有Amp^r、Tet^r的     在丙中能存活，在乙中不能存活

點(diǎn)評(píng) 本題考查了基因工程和胚胎干細(xì)胞的相關(guān)知識(shí)，考生要能夠通過(guò)菌落培養(yǎng)的情況確定重組質(zhì)粒中破壞的抗性基因，進(jìn)而確定使用的限制酶，要求考生具有一定的析圖能力和理解判斷能力，難度適中．