Question

【題目】人乳鐵蛋白（hLF）對細(xì)菌、真菌和病毒等都有抑制作用。研究人員開展人乳鐵蛋白基因乳腺特異性表達(dá)載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)染研究，主要流程如下圖，圖中Ase I、Nhe I、Sal I、BamH I代表相關(guān)限制酶切點(diǎn)，neor為新霉素抗性基因，BLG基因?yàn)?/span>B乳球蛋白基因，GFP基因?yàn)榫G色熒光蛋白基因。請回答：

（1）過程①中，不能從人肌肉細(xì)胞中提取RNA用于RT-PCR，是因?yàn)?/span>_______________。在RT—PCR過程中，加入的引物需在5’端添加_______________兩種限制酶的識別序列，以便于hLF基因插入pEB中。

（2）過程②中，hLF基因插入到BLG基因之后的目的是_______________。

（3）將轉(zhuǎn)染后的山羊乳腺上皮細(xì)胞先置于含新霉素的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，能夠存活的細(xì)胞應(yīng)該是導(dǎo)入_______________的細(xì)胞，再利用熒光顯微鏡觀察山羊乳腺上皮細(xì)胞中_______________，以篩選出轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞。

（4）要獲得轉(zhuǎn)基因山羊，還需要將成功表達(dá)hLF的乳腺上皮細(xì)胞的細(xì)胞核移植到山羊去核卵母細(xì)胞中，再借助_________________技術(shù)孕育出羊羔。

Answer 1

【答案】hLF基因在人肌肉細(xì)胞中不轉(zhuǎn)錄（表達(dá)） Sal I和BamH I 使人乳鐵蛋白基因在山羊的乳腺細(xì)胞中表達(dá)（或使目的基因表達(dá)） pEB質(zhì)粒或pEBL質(zhì)粒（或普通質(zhì)�；蛑亟M質(zhì)粒） 是否有綠色熒光（或是否有熒光） 早期胚胎培養(yǎng)和胚胎移植

【解析】

基因工程技術(shù)的基本步驟：

（1）目的基因的獲取：方法有從基因文庫中獲取、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增和人工合成。

（2）基因表達(dá)載體的構(gòu)建：是基因工程的核心步驟，基因表達(dá)載體包括目的基因、啟動子、終止子和標(biāo)記基因等。

（3）將目的基因?qū)�入受體細(xì)胞：根據(jù)受體細(xì)胞不同，導(dǎo)入的方法也不一樣。將目的基因?qū)�入植物�?xì)胞的方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因?qū)�入動物�?xì)胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因?qū)�入微生物�?xì)胞的方法是感受態(tài)細(xì)胞法。

（4）目的基因的檢測與鑒定：分子水平上的檢測：①檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA是否插入目的基因--DNA分子雜交技術(shù)；②檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA--分子雜交技術(shù)；③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)--抗原-抗體雜交技術(shù)。個體水平上的鑒定：抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等。

（1）人肌肉細(xì)胞使高度分化的細(xì)胞，hLF基因在人肌肉細(xì)胞中不轉(zhuǎn)錄（表達(dá)），故過程①中，不能從人肌肉細(xì)胞中提取RNA用于RT-PCR。Sal I和BamH I在質(zhì)粒上挨著，切割質(zhì)粒不破壞其他基因，故在RT-PCR過程中，加入的引物需在5'端添加Sal I和BamH I兩種限制酶的識別序列，以便于hLF基因插入pEB中。

（2）過程②重組載體的構(gòu)建，hLF基因插入到BLG基因之后的目的是使人乳鐵蛋白基因在山羊的乳腺細(xì)胞中表達(dá)。過程③重組載體導(dǎo)入受體細(xì)胞，使用人工膜制成的脂質(zhì)體將重組質(zhì)粒導(dǎo)入受體細(xì)胞，依據(jù)的主要原理是生物膜具有一定的流動性。

（3）neo′為新霉素抗性基因，具有抗新霉素的作用，故將轉(zhuǎn)染后的山羊乳腺上皮細(xì)胞先置于含新霉素的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，能夠存活的細(xì)胞應(yīng)該是導(dǎo)入pEB質(zhì)粒或pEBL質(zhì)粒的細(xì)胞，GFP基因?yàn)榫G色熒光蛋白基因，作為標(biāo)記基因，可再利用熒光顯微鏡觀察山羊乳腺上皮細(xì)胞中是否有綠色熒光，以篩選出轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞。

（4）要獲得轉(zhuǎn)基因山羊，還需要將成功表達(dá)hLF的乳腺上皮細(xì)胞的細(xì)胞核移植到山羊去核卵母細(xì)胞中，再借助早期胚胎培養(yǎng)和胚胎移植技術(shù)孕育出羊羔。